人羊水来源干细胞与生物可降解材料体内外复合培养构建组织工程膀胱平滑肌

目的 探讨体外高效地诱导人羊水来源干细胞向平滑肌样细胞的分化,评估细胞与聚羟基乙酸(PGA)支架复合物的生物相容性,由此探讨该复合物用于组织工程膀胱平滑肌重建的可行性.方法 孕中期B超引导下穿刺抽取羊水,体外分离挑选原代人羊水来源的干细胞(hAFCESs),取第三代细胞用肌源性生长因子(PDGF-BB)和转化生长因子β1(TGF-β1)和左旋维生素C(L-AA)在体外分别诱导分化3周、4周和5周,然后光镜下观察诱导后细胞生长的形态变化,免疫荧光细胞染色和RT-PCR检测平滑肌细胞的标志物.取第四代人羊水来源干细胞种植到非编织PGA材料上,体外诱导培养4周后移植到裸鼠背部皮下,4周后取材进行体内外种植效果的评价.结果 hAVESCs体外增殖能力强,RT-PCR、免疫荧光细胞染色显示经诱导的hAFCSCs表达平滑肌细胞的标志物平滑肌肌动蛋白(α-SMA),肌钙蛋白(CALP),平滑肌22α(SM22α)和肌球蛋白重链(MHC).PGA支架上的hAFCSCs在种植4 h后开始正常贴附、生长和增殖,细胞形态良好.扫描电镜显示hAFCSCs紧密贴附到PGA支架材料上并分泌细胞外基质.冰冻切片免疫荧光染色显示组织块中表达平滑肌细胞的标志物.结论 hAFCSCs能在肌源性生长因子(PDGF-BB和TGF-β1)和左旋维生素C(LAA)的诱导作用下高效地分化为平滑肌样细胞.复合hAFCSCs的PGA支架体外具有良好的生物相容性及体内较好的组织相容性,表明以hAFCSCs为种子细胞、PGA为支架构建组织工程膀胱平滑肌具有可行性.

Abstract：

Objective To investigate the potential of human amniotic fluid colony-derived stem cells (hAFCSCs) efficiently differentiating into smooth musle cells,and evaluate the biocompatibility of cell-PGA composite scaffolds and the fesibility of reconstraction of bladder smooth muscle tissue in vitro and in vivo . Methods hAFCSCs were obtained from second trimester amniotic fluid by ultrasound-guided amniocentesis performed on pregnant women. After expended in vitro, the 3rd generation hAFCSCs were induced in myogenic differentiation medium supplemented by myogenic growth factors (PDGF-BB and TGF-(31) and L-Ascorbic acid(L-AA) for 3 weeks,4 weeks and 5 weeks,and the differentiated cells were identified morphologically and the myogenic phenotype were detected by gross observation,RT-PCR and immunofluorescence staining. The 4th generation hAFCSCs cells were seeded onto polyglycolic acid (PGA) unwoven fiber scaffolds and cultured for 4 weeks in vitro in myogenic differentiation medium, then PGA-cell composite scaffolds and pure scaffolds were separately implanted into subcutaneous pockets of nude mice. After 4weeks of implantation, the specimens were harvested and examined. Results The hAFCSCs expended rapidly in vitro. After induction with myogenic growth factors and L-AA,RT-PCR and immunofluorescence staining demonstrated that a-smooth muscle actin(α-SMA), calpommCALP ) smooth muscle 22a (SM22α) and myosin heavy chain(MHC) were expressed. The adhesion and proliferation of hAFCSCs on PGA fiber scaffolds were observed after 4 h.. As polymer degradation degraded, the hAFCSCs kept proliferation and converged. Microscopic and scanning electron microscope (SEM) observations showed that hAFCSCs spreaded over the PGA fibers with secreted extracellular matrices filling the space among the fibers. . Conclusions hAFCSCs derived from second trimester amniotic fluid can be efficiently induced into smooth muscle cells by myogenic growth factors (PDGF-BB and TGF-β1) and L-AA in vitro. The PGA possesses good biocompatibility and histocompatibility with hAFCSCs in vitro and in vivo. This preliminary work indicates the feasibility to generate urinary bladder smooth muscle tissue with tissue engineering technique.     

碱性成纤维细胞生长因子和Noggin诱导人羊水来源干细胞向神经细胞分化的差异比较***☆

背景：相对于成体干细胞和胚胎干细胞自身存在的问题,羊水来源的干细胞系的建立,能为每一个个体建立一份自身的、具有高度增殖分化能力的干细胞储备,有望成为神经性退行性疾病细胞治疗的理想细胞来源。 目的：观察Noggin和碱性成纤维细胞生长因子对人羊水来源干细胞向神经细胞分化的影响。 方法：羊水标本来自怀孕16~22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得。利用CD117抗体,选用免疫磁珠法从人孕中期羊水标本中分离获得羊水干细胞,培养扩增后,通过流式细胞仪检测表面抗原表达进行鉴定。选取生长状态良好的第3代羊水干细胞,利用无血清的神经诱导培养液诱导其向神经细胞分化,分为空白对照组、基础诱导液组、Noggin诱导组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组。倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态的变化,细胞免疫荧光检测巢蛋白、β-Ⅲ tubulin和神经丝蛋白在诱导后细胞中的表达。 结果与结论：利用免疫磁珠方法分离出的羊水干细胞呈CD44和HLA-ABC表达阳性,CD45和HLA-DR表达阴性。诱导2周后,碱性成纤维细胞生长因子诱导组光镜下细胞形态发生显著变化,免疫荧光染色巢蛋白、β-Ⅲ tubulin和神经丝蛋白表达阳性率较高。Noggin诱导组细胞形态和染色结果与基础诱导液组无显著性差异。提示利用羊水来源的干细胞诱导分化为神经细胞的过程中碱性成纤维细胞生长因子的作用远优于Noggin。     

荧光纳米颗粒NaYF_4:Yb,Er作为显像介质的生物相容性

目的检测上转频荧光纳米颗粒的生物学体内、外相容性,证实其作为显像介质的生物安全性。方法将培育后的小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)、胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)及成肌细胞(C2C12)分别与不同浓度(0、10、50、100、200μg/mL)的NaYF4:Yb,Er共孵育,采用MTT法检测细胞的增殖活性,并测定C2C12成肌细胞形成肌管细胞的功能。将NaYF4:Yb,Er纳米颗粒DMEM混悬液注射入C57BL/6小鼠,行小鼠肝肾功能测定;并对重要脏器行HE组织学染色,检测小鼠的体内毒性。结果 MTT法细胞毒性检测显示,NaYF4:Yb,Er纳米颗粒对NIH/3T3和C2C12的毒性呈剂量与孵育时间正相关性(NIH/3T3:r=0.974,P<0.05;C2C12:r=0.996,P<0.05);而对BMSC的毒性并没有表现出剂量与孵育时间具有相关性(r=-0.218,P>0.05)。NaYF4:Yb,Er纳米颗粒孵育48h后,对C2C12成肌细胞形成肌管细胞功能未见明显影响。小鼠被注射NaYF4:Yb,Er纳米颗粒DMEM混悬液2、4周后,肝肾功能及重要脏器均未见明显损伤。结论 NaYF4:Yb,Er纳米颗...     

免扩口法在后腹腔镜下重度积水无功能肾切除术中的临床应用分析

目的:探讨免扩口取标本法在后腹腔镜下重度积水无功能肾切除术中的临床应用价值.方法:回顾性分析2015年2月-2018年12月在潍坊市人民医院采用后腹腔镜下重度积水无功能肾切除术治疗的52例无功能肾患者的资料,根据标本取出方式的不同分为免扩口取标本组(n=22)和传统取标本组(n=30).比较两组手术时间、切口长度、标本...     

甲状旁腺激素、降钙素的变化与上尿路结石的相关研究

目的:研究上尿路结石患者甲状旁腺素(PTH)、降钙素(CT)的变化及意义.方法:选择潍坊市人民医院泌尿外科2014年12月~2016年3月的上尿路结石住院患者为观察对象,根据复发情况分为结石组与复发性结石组,随机选取在本院查体的50位健康成年人为对照组,检测血清钙、磷、PTH、CT水平,计算PTH/CT值.比较三组之间的差异.结果:复发性结石组与结石组的PTH高于对照组(P<0.05),复发组PTH高于结石组(P<0.05);两组CT水平均低于对照组(P<0.05);复发组与结石组PTH/CT值高于对照组,复发组PTH/CT值高于结石组.结论: PTH与CT的变化是引起上尿路结石反复发作的原因之一, PTH/CT值增高可能与上尿路结石的发生及复发有关.     

碱性成纤维细胞生长因子和Noggin诱导人羊水来源干细胞向神经细胞分化的差异比较

背景:相对于成体干细胞和胚胎干细胞自身存在的问题,羊水来源的干细胞系的建立,能为每一个个体建立一份自身的、具有高度增殖分化能力的干细胞储备,有望成为神经性退行性疾病细胞治疗的理想细胞来源.目的:观察Noggin和碱性成纤维细胞生长因子对人羊水来源干细胞向神经细胞分化的影响.方法:羊水标本来自怀孕16-22周行产前诊断的孕妇,在超声引导下行羊膜腔穿刺取得.利用CD117抗体,选用免疫磁珠法从人孕中期羊水标本中分离获得羊水干细胞,培养扩增后,通过流式细胞仪检测表面抗原表达进行鉴定.选取生长状态良好的第3代羊水干细胞,利用无血清的神经诱导培养液诱导其向神经细胞分化,分为空白对照组、基础诱导液组、Noggin诱导组和碱性成纤维细胞生长因子诱导组.倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态的变化,细胞免疫荧光检测巢蛋白、β-Ⅲtubulin和神经丝蛋白在诱导后细胞中的表达.结果与结论:利用免疫磁珠方法分离出的羊水干细胞呈CD44和HLA-ABC表达阳性,CD45和HLA-DR表达阴性.诱导2周后,碱性成纤维细胞生长因子诱导组光镜下细胞形态发生显著变化,免疫荧光染色巢蛋白、β-Ⅲ tubulin和神经丝蛋白表达阳性率较高.Noggin诱导组细胞形态和染色结果与基础诱导液组无显著性差异.提示利用羊水来源的干细胞诱导分化为神经细胞的过程中碱性成纤维细胞生长因子的作用远优于Noggin.     

3种细胞因子在膀胱尿路上皮癌的表达及其临床意义

目的探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、CD74、血管内皮生长因子(VEGF)在膀胱尿路上皮癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学方法对80例膀胱尿路上皮癌患者癌组织和15例膀胱正常组织中MIF、CD74和VEGF的蛋白表达水平进行检测,并分析其与临床病理特征和预后的关系。结果 MIF、CD74和VEGF在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,在正常膀胱黏膜组织中无或弱表达,差异有统计学意义(P0.05)。肿瘤细胞胞质内MIF、CD74和VEGF的表达与组织学分类、病理分级、临床分期均呈正相关(P0.05)。而且相关性分析发现,MIF与CD74在膀胱尿路上皮癌组织中的表达呈正相关(r=0.839,P0.05),且MIF与VEGF在膀胱尿路上皮癌组织中的表达亦呈正相关(r=0.753,P0.05)。结论 MIF可能通过与CD74相互作用,上调VEGF表达促进肿瘤微血管生成,促进膀胱尿路上皮癌的发生发展,使其有望成为膀胱尿路上皮癌治疗的有效靶分子。     

人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞诱导的体外实验研究

目的 探讨成肌细胞条件培养液体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞分化的可行性.方法 B超引导下穿刺抽得孕中期羊水,体外培养、分离得到羊水来源间充质干细胞.鼠成肌细胞体外培养后收集上清液,检测上清液中半乳糖凝集素-1（Galectin-1）含量,并制备成肌细胞条件培养液.实验组于成肌细胞条件培养液中培养,对照组于成肌细胞诱导培养液中培养.观察2组细胞形态学变化,免疫荧光染色、RT-PCR检测成肌细胞特异性标志物Pax7、MyoD、肌结蛋白（Desmin）、肌钙蛋白Ⅰ（Tn Ⅰ）及mRNA表达情况.结果 倒置相差显微镜下可见实验组细胞诱导第18天出现折光性强、体积较小的细胞,呈多角形,并带有突起,且逐渐成长条形;可见少量多核细胞.对照组细胞呈扁平多角形,胞体较大.诱导24 d免疫荧光染色及RT-PCR提示实验组细胞不同程度表达Pax7、MyoD、Desmin、TnⅠ及mRNA;对照组呈阴性.成肌细胞培养上清液中半乳糖凝集素-1含量较低.结论 成肌细胞条件培养液能诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化.     

应用5-杂氮脱氧胞苷诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的体外研究

目的 探讨5-氮杂脱氧胞苷(5-AzaC)体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的可行性.方法 B超引导下穿刺抽得孕中期羊水,体外分离、培养得到羊水来源间充质干细胞,传代后计数细胞并绘制生长曲线.体外成骨、成脂诱导观察人羊水来源间充质干细胞多向分化能力.采用5-AzaC对羊水来源间充质干细胞成肌诱导2周,观察细胞形态学变化,RT-PCR、免疫荧光染色方法鉴定成肌细胞特异mRNA及蛋白表达.结果 人羊水来源间充质干细胞体外培养后迅速进入对数生长期,培养7 d未达到平台期.茜素红和油红O染色证实人羊水来源间充质干细胞可诱导分化为成骨、成脂细胞样细胞.人羊水来源间充质干细胞经5-AzaC诱导2周逐渐变长梭形.而对照组细胞呈扁平多角形.免疫荧光染色及RT-PCR结果提示实验组细胞表达肌结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白I(Tn I)、横纹肌辅肌动蛋白(α-Actinin)及mRNA;对照组呈阴性.结论 人羊水来源间充质干细胞体外增殖能力强,能分化为成骨、成脂细胞样细胞.5-AzaC能在体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化.     

荧光纳米颗粒NaYF4:Yb,Er作为显像介质的生物相容性

目的 检测上转频荧光纳米颗粒的生物学体内、外相容性,证实其作为显像介质的生物安全性。方法 将培育后的小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）、胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）及成肌细胞（C2C12）分别与不同浓度（0、10、50、100、200 μg/mL）的NaYF4:Yb,Er共孵育,采用MTT法检测细胞的增殖活性,并测定C2C12成肌细胞形成肌管细胞的功能。将NaYF4:Yb,Er纳米颗粒DMEM混悬液注射入C57BL/6小鼠,行小鼠肝肾功能测定;并对重要脏器行HE组织学染色,检测小鼠的体内毒性。结果 MTT法细胞毒性检测显示,NaYF4:Yb,Er纳米颗粒对NIH/3T3和C2C12的毒性呈剂量与孵育时间正相关性（NIH/3T3：r=0.974,P<0.05;C2C12：r=0.996,P<0.05）;而对BMSC的毒性并没有表现出剂量与孵育时间具有相关性（r=-0.218,P>0.05）。NaYF4:Yb,Er纳米颗粒孵育48 h后,对C2C12成肌细胞形成肌管细胞功能未见明显影响。小鼠被注射NaYF4:Yb,Er纳米颗粒DMEM混悬液2、4周后,肝肾功能及重要脏器均未见明显损伤。结论 NaYF4:Yb,Er纳米颗粒作为具有强荧光强度的显影介质,在体内、外显影需求浓度下对细胞毒性及全身各重要器官的损伤均在安全范围内,是一种优秀的生物成像显影介质。