pcDNA3.1/hIL-18真核表达载体的构建及表达

目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础     

甲状腺肿瘤cyclin E蛋白与PCNA的表达特点及相关性

目的：研究甲状腺肿瘤cyclinE蛋白及增殖细胞核抗原（PCNA）的表达特点及相关性。方法：采用免疫组织化学SABC法,检测68例甲状腺组织（其中癌旁“正常”甲状腺组织5例,甲状腺腺瘤16例,甲状腺癌47例）细胞中cyclinE与PCNA的表达。结果：cyclinE的异常表达是甲状腺肿瘤形成的早期事件,且cyclinE与PCNA标记指数呈显著的相关性（X2=24．218,P＜0．005）。结论：cyclinE的异常表达参与甲状腺肿瘤的发生与发展过程．其可能是通过改变细胞周期及促进细胞异常增殖而起作用的,cyclinE可做为组织细胞增殖的又一标志。     

Notch和Wnt信号通路及两者的交叉串话与乳腺癌发生、发展的关系

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，而且是女性癌症死亡的最主要原因。对于乳腺癌的发病机制，目前尚不清楚。Notch和Wnt信号通路在多细胞生物的生长、发育及肿瘤形成中起着至关重要的作用，两者之间存在着直接或间接的串话。笔者就这2条信号通路在乳腺肿瘤的发生、发展过程中所表现出来的相互协同作用进行综述。     

嗅鞘细胞移植后通过分泌MMP-3在RCS-P~+大鼠视网膜中迁移

目的初步研究将嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)及嗅球成纤维细胞(olfactory nerve fibroblasts,ONF)混合细胞移植到皇家外科学院大鼠(Royal College of Surgeon rat,RCS-P+rat)的视网膜下腔后,OECs/ONF迁移进入视网膜的机制。方法离体实验中,取成年RCS-rdy+-P+大鼠的嗅球培养OECs/ONF至14 d行OECs/ONF的基质金属蛋白酶-3(matrix-metalloproteinase-3,MMP-3)细胞免疫荧光染色。收集5、8、11、14 d OECs/ONF培养液上清,与普通培养液超滤后进行酶联免疫吸附实验(ELISA),检测MMP-3的含量变化。在体实验中,制作40只RCS-P+大鼠单眼视网膜下腔细胞移植,并以对侧眼作为伪手术组以及相同天龄未处理大鼠作为对照组。术后7、14、21、28 d用ELISA法检测细胞移植组、伪手术组及未处理组大鼠视网膜中MMP-3含量的变化。将携带绿色荧光的慢病毒感染后的OECs/ONF移植到4只RCS-P+大鼠视网膜下腔,激光共聚焦显微镜观察移植后7、14、21 d及28 d OECs/ONF在视网膜中迁移情况。结果离体实验中,培养14 d时OECs/ONF的MMP-3免疫细胞化学染色阳性。OECs/ONF培养液上清MMP-3含量分别为5 d(2.83±0.80)、8 d(6.34±1.12)、11 d(11.65±1.35)、14 d(19.11±2.11),明显高于普通D/F12+10%FBS培养液(1.65±0.44)(P<0.01);在体实验中,移植后21 d及28 d,OECs/ONF移植组视网膜MMP-3的含量[(1.80±0.29)、(3.96±0.51)]明显高于伪手术组[(1.17±0.20)、(1.83±0.26)]和未处理组[(1.19±0.17)、(1.92±0.25)](P<0.01),伪手术组与未处理组之间无明显统计学差异(P>0.05)。激光共聚焦显微镜观察可见移植后7～28 d,OECs/ONF在视网膜中迁移,最远能够达到神经节细胞层。结论 OECs/ONF移植到RCS视网膜下腔后,可能通过分泌MMP-3在RCS-P+大鼠视网膜中迁移。     

RNA干扰对流感病毒NP和PA基因表达及病毒增殖的抑制

目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对流感病毒NP或/和PA基因的siRNA抑制NP或/和PA基因的表达及抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖. 方法: 分别构建针对NP,PA及同时干扰NP和PA的三种siRNA表达质粒pEGFP/NP,pGenesil/PA和pEGFP/NP PA,转染MDCK后,H5N1亚型流感病毒感染细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测NP及PA蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点检测细胞培养上清中的血凝值(HA),观察siRNA抑制流感病毒增殖的能力. 结果: 荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达65.0%. 蛋白质印迹结果表明,重组质粒pEGFP/NP和pEGFP/NP PA均能抑制NP蛋白在MDCK细胞内的表达,两者的抑制率分别为64.5%和69.6%. 半定量RT-PCR检测到pEGFP/NP质粒在MDCK细胞内对NP基因的转录抑制率为66.0%;pGenesil/PA质粒对PA基因的转录抑制率为63.0%;pEGFP/NP PA质粒对NP和PA基因的转录同时抑制率,分别为71.4%和69.3%. 而对照质粒pEGFP/HK对NP或/和PA基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. HA结果表明,三种质粒均能抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖,以pEGFP6/NP PA的作用最为显著,它们抑制流感病毒增殖的能力分别为87.0%,75.0%和96.9%. 结论: NP或/和PA基因的siRNA质粒可明显抑制NP或/和PA基因的转录和表达,并有效地抑制流感病毒在MDCK细胞中的增殖.     

181例老年高血压患者心电图临床分析

老年高血压是老年人脑血管意外和冠心病的主要危险因素。本文根据高血压标准将181例老年高血压患者分为收缩期高血压组和一般高血压组,并对其心电图变化进行了临床分析,结果表明两组室性早搏和房性早搏的发生有显著差异,收缩期高血压患者多见,且与并发冠状动脉粥样硬化有关。     

视网膜变性对RCS-P+大鼠γ-氨基丁酸及其合成酶谷氨酸脱羧酶65表达的影响

目的 观察视网膜变性过程中γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)及合成酶谷氨酸脱羧酶65(glutamic acid decarboxylase 65,GAD65)的表达变化.方法 选择出生后15、30、60、90 d的RCS-P+和同年龄的RCS-rdy+-P+大鼠,采用免疫荧光(IF)和免疫印迹法(Western blot)观察两种大鼠出生后15、30、60、90 d GABA和GAD65的表达差异.结果 视网膜中GABA和GAD65主要表达于内核层、内从状层和节细胞层.随着天龄的增加,RCS-rdy+-P+大鼠中GABA阳性细胞逐渐减少.RCS-P+变性鼠在出生后15 ～60 d GABA阳性细胞随天龄增加逐渐减少,在出生后60 ～ 90 d(即视网膜变性中晚期)GABA阳性细胞大量增加,GABA表达明显高于RCS-rdy+-P+大鼠(P＜0.05).不同年龄RCS-rdy+-P+大鼠其GAD65表达恒定,发育对GAD65表达无明显影响;与同年龄RCS-rdy+-P+大鼠相比,30 d RCS-P+大鼠GAD65表达略有增加(P＜0.05),90d时大量增加(P＜0.01),其表达随病变发展明显升高.结论 在视网膜色素变性过程中,GABA、GAD65在视网膜内层的表达均有显著的升高,提示输入剥夺后GABA能无长突细胞未见损伤,其活性甚至略有增高.     

RNA干扰技术抑制EC-109细胞survivin基因表达及其促凋亡研究

目的:应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对survivin基因的siRNA,抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC-109细胞的凋亡. 方法:构建针对survivin的siRNA表达质粒,转染至EC-109细胞,荧光显微镜判断转染效率,蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化,并在不同时间点收集转染细胞,利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒,观察siRNA抑制survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况. 结果:荧光显微镜结果表明,重组质粒转染效率达46.70%. 半定量RT-PCR检测到pSIREN/S质粒在EC-109细胞内对survivin基因的转录抑制率为74.04%;蛋白质印迹结果表明,转染重组质粒pSIREN/S的EC-109细胞survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%,而对照质粒pSIREN/CN对survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. 经pSIREN/S转染的EC-109细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder,流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%. 结论:survivin特异性siRNA可明显抑制survivin基因的转录和表达,并能有效地诱导EC-109细胞的凋亡,为下一步在体内利用pSIREN/S重组质粒沉寂survivin基因,促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础.     

人重组TNF-α突变体471蛋白的初步纯化及生物学活性

目的：在利用原核表达系统表达重组人突变体471 TNF—α蛋白的基础上，对该蛋白进行初步纯化及生物学活性检测。方法：利用最佳发酵和表达条件，诱导基因重组的人突变体471 TNF—α工程菌表达目的蛋白。收集菌体，经超声破碎，分离人突变体471 TNF—α的包涵体，并观察变性剂及蛋白浓度对蛋白折叠的影响。采用MTT比色法检测并比较人野生型及突变体471 TNF—α的生物学活性。结果：在适当的变性与复性条件下，已成功地将突变体471 TNF—α折叠并聚合形成具有生物学活性的三聚体。突变体471 TNF—α对L929的细胞毒活性高于野生型TNF—α的15倍。结论：原核表达系统中表达的人突变体471 TNF—α经复性处理后具有显著的生物学活性，为进一步进行动物实验及临床研究奠定了基础。     

突变型与野生型TNF-α诱导肿瘤细胞的凋亡

目的：比较重组人突变型471rhTNF-αt（mt 471rhTNF-α）与野生型rhTNF-α（wt rhTNF-α）诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力．并对mt 471rhTNF—α诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究．方法：以乳腺癌细胞系ZR75—1细胞为靶细胞,应用基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析mt 471rhTNF—α与wt rhTNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的情况;利用以ELISA为基础的Trans AMTMNF—KBp65试剂盒检测经mt471 rhTNFα或wt rhTNF-α处理的ZR75—1细胞核因子NF—kB的活化情况,以便对其诱导凋亡的机制进行初步的研究．结果：20g/L琼脂糖凝胶电泳显示,mt 471rhTNF—α处理组的ZR75—1细胞基因组DNA呈现明显的ladder状分布,wt rhTNF-α处理组的“ladder”条带明显减弱;流式细胞仪分析显示,mt 471rhTNF-α诱导的细胞凋亡峰面积高于wt rhTNF-α处理组．NF—kB活化检测结果显示,当两型rhTNF-α浓度增高到50μg／L时．wt rhTNF-α处理组的NF-kB的活化量明显高于同浓度的mt 471rhTNF-α处理组（P=0．002）．结论：mt 471rhTNF-α诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显优于wt rhTNF-α;肿瘤细胞内NF—kB活化明显受抑是mt 471rhTNF-α诱导凋亡能力增强的主要原因之一．