大肠杆菌CodA基因表达赋予转基因青蒿负选择表型

目的为了验证CodA基因是否适宜作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。方法用PCR法扩增大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因CodA,经克隆和测序后插入植物基因表达载体pROK,并导入根癌农杆菌LBA4404(pAL4404)中。以共培养法转化青蒿叶盘,在添加25μg/mL卡那霉素(Kan)的N6培养基上选择青蒿转化愈伤组织并再生绿芽。将Kan抗性转基因青蒿芽转植到含有500μg/mL5-氟胞嘧啶(5-FC)和25μg/mLKan的MS培养基上继续培养2周。结果转基因青蒿芽全部死亡,而未转化青蒿芽仍正常生长,表明导入CodA基因的青蒿细胞已赋予其预期的负选择表型。经RT-PCR检测,转基因青蒿芽显示CodA阳性扩增带,而未转化青蒿芽无此特异扩增带。这一结果显示,CodA基因已在青蒿细胞中转录生成相应的mRNA,从而进一步印证了表型检测结果。结论CodA基因可作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。     

青蒿萜类合成途径的交流模式(英文)

【目的】探讨青蒿细胞质与质体中的萜类合成途径的相互关系。【方法】用甲羟戊酸(MVA)途径抑制剂洛伐他汀、脱氧木酮糖磷酸(DXP)途径抑制剂磷甘霉素及类固醇合成抑制剂咪康唑对青蒿苗进行处理,对途径终产物——β-胡萝卜素和生育酚的生成以及细胞质内的MVA途径关键酶基因(HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、SQS)和质体内的DXP途径关键酶基因(DXS、DXR)的转录表达水平的动态变化进行了定量依时分析。【结果】洛伐他汀对MVA途径基因(HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR、SQS)和DXP途径基因(DXS、DXR)的转录均有抑制作用,但对DXP途经终产物(β-胡萝卜素和生育酚)的合成无显著影响,叶片也并未出现白化。磷甘霉素处理后对DXS、DXR转录和β-胡萝卜素、生育酚合成有持续抑制作用,但MVA途径基因转录在3h瞬时提高,青蒿苗同时出现短根和叶片白化现象。添加咪康唑后青蒿素合成基因(ADS、CYP71AV1、CPR)的转录水平分别提高11、5和3倍。【结论】表明青蒿2条萜类合成途径之间存在物质交流,且流动方向可能以叶绿体向胞浆流动为主,抑制青蒿素合成竞争途径可调节细胞代谢向青蒿素合成方向移动。     

低温诱导黄花蒿中青蒿素的生物合成及其机制研究

目的 研究低温处理对黄花蒿中青蒿素及其他萜类合成通路的影响。方法 以4 ℃为胁迫条件,利用高效液相色谱法测定青蒿素量;硫酸钛沉淀法和N, N-二甲基-对-亚硝基苯胺漂白反应分别检测黄花蒿叶片过氧化氢（H²O²）和单线态氧（¹O²）量;紫外分光光度法检测过氧化氢酶（CAT）活性;实时荧光定量PCR技术定量分析青蒿素合成途径及竞争途径关键酶基因的表达。结果 4 ℃处理4 h后黄花蒿叶片中¹O²和H²O²量升高,并伴随着青蒿素量和CAT活性逐步提高,4、24、48 h后青蒿素量分别提高20%、65%、80%;4 ℃处理24 h后,青蒿素合成相关基因（HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR和DBR2）的表达普遍上调,其中ADS基因的表达提高16倍;而青蒿素合成竞争途径酶（β-石竹烯合酶）基因（CS）表达则下调近20倍。结论 低温刺激可能通过产生高浓度活性氧（ROS）促进青蒿素合成前体转化,上调青蒿素合成相关基因表达并抑制竞争途径基因表达等途径促进青蒿素合成。     

重组人细胞因子基因在转基因中药细胞中的瞬时表达

目的 利用转基因中药表达人细胞因子基因，探讨培育基因修饰（GM）中药的可行性，方法 将体外扩增分别获得的人α-干扰素基因与RANTES基因酶切回收后插入中间载体，用EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定重组子，由大肠杆菌分离重组质粒并导入根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens，通过加入卡那霉素（Km)和利福平（Rif)筛选含重组双元载体的转化子，用叶盘共培养法转化苦瓜和夏枯草外植体。结果 经RT-PCR检测到人α-干扰素基因与RANTES基因在中药转化愈伤组织中的瞬时表达。结论 首次报道了重组人α-干扰素基因与RANTES基因在转基因苦瓜和夏枯草细胞中的表达。为探讨利用转基因中药抗病毒尤其是抗艾滋病开创了新途径。     

心理护理对脑卒中后焦虑、抑郁患者预后的影响

目的 探讨心理护理对脑卒中后焦虑、抑郁患者预后的影响及其临床意义.方法 将102名脑卒中患者随机分为对照组53例,干预组49例.两组均采取脑卒中后常规治疗和护理,同时干预组实施心理护理.在治疗前,治疗后1个月,治疗后6个月分别对两组患者进行综合医院焦虑抑郁量表(HADS),改良爱丁堡斯堪的那维亚卒中量表(MESSS)评定.结果 治疗前,焦虑抑郁评分干预组明显高于对照组(P＜0.05),余无明显差异(P＞0.05).1个月后,焦虑抑郁评分和卒中量表评分两组差异无显著性(P＞0.05).6个月后,卒中量表评分,干预组明显低于对照组(P＜0.05),余差异无显著性(P＞0.05).结论 心理护理不仅明显改善脑卒中后焦虑和抑郁状态,同时对神经功能的恢复有积极的促进作用.     

人RANTES基因克隆与测序

目的 获得人趋化因子ＲＡＮＴＥＳ基因,用于抗艾滋病转基因中药的培育。方法 ＲＴ－ＰＣＲ扩增、目的基因片段与Ｔ－载体连接和有用基因的序列分析。结果 通过淋巴细胞激活、ＲＮＡ分离和ＲＴ－ＰＣＲ扩增,已获得预期的２７６ｂｐ片段,并经ＰＣＲ和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果表明,克隆基因片段包含了编码ＲＡＮＴＥＳ基因信号肽与成熟蛋白的完整序列以及起始和终止密码,但编码信号肽的－１０位密码子（ＧＴＴ）与已发     

心理护理干预对脑卒中病人生存质量影响的研究

[目的]探讨心理护理干预对脑卒中病人生存质量的影响及其临床护理意义。[方法]将102例脑卒中病人随机分为对照组53例和干预组49例。两组病人均采取脑卒中后常规治疗和护理,干预组同时实施心理护理。在治疗前及治疗后6个月分别对两组病人进行生存质量量表(WHOQOL-BREF)、综合医院焦虑抑郁量表(HADS)、改良爱丁堡斯堪的那维亚卒中量表(MESSS)评定。[结果]治疗前,除焦虑和抑郁评分干预组明显高于对照组(P<0.05)外,其余两组无明显差异(P>0.05)。6个月后WHOQOL-BREF评分干预组明显高于对照组(P<0.01),MESSS评分干预组明显低于对照组(P<0.05)。[结论]心理护理干预不仅有利于脑卒中病人神经功能康复,而且对病人的生存质量有积极的促进作用。     

重组人乙型肝炎病毒S基因表达的体内外评价

目的 构建能表达乙型肝炎病毒（HBV）S基因的DNA疫苗，并在离体与活体条件下评价重组S基因的表达。方法 将克隆的S-X基因片段插入真核细胞表达载体。获得重组质粒，在离体转录系统与转染细胞系中表达重组S基因。并在小鼠中评价HBsAg激发抗-HBs的效果。结果 S基因的表达已通过Northern印迹杂交，Western印迹杂交和ELISA（抗原及抗体检测）予以证实。结论 S基因已成功地实现体外重组与表达。     

红花黄色素对乳腺癌耐药细胞MCF－7／ADR 缝隙连接蛋白 Cx43的影响

目的：观察红花黄色素对乳腺癌耐药细胞MCF－7／ADR缝隙连接蛋白Cx43的影响。方法取对数生长期的MCF－7／ADR细胞,以2×105 cells／孔接种于6孔培养板,24 h后分为4组,每组3孔,其中3组分别加入红花黄色素至终浓度25、50、100 mg／L,另一孔设为空白对照组,作用48 h。 Western blot法检测各组MCF－7／ADR细胞中Cx43表达水平。结果不同浓度红花黄色素作用于MCF－7／ADR细胞48 h后, Cx43表达水平均增高,有明显的剂量依赖关系,以50、100 mg／L浓度作用显著（ P＜0．01）。结论红花黄色素能提高乳腺癌耐药细胞MCF－7／ADR缝隙连接蛋白Cx43的表达水平。     

青蒿素生物合成基因的转录谱分析

【目的】研究青蒿素生物合成基因在不同发育时期和不同组织中的表达规律,探讨青蒿素生物合成的时空调节机制。【方法】利用实时荧光定量PCR技术定量追踪分析青蒿素主要及协同合成途径基因在盛叶期、开花前、开花后不同的发育时期,以及在根、茎、叶、花不同组织中的表达模式。【结果】各基因的表达水平在6月份时最低,随后开始上升,在8月份(开花前)达到高峰,与6月份比较,转录水平显著提高3～15倍(均P0.01),其中青蒿素特异合成酶基因ADS和CYP71AV1上升幅度最大,为最低水平的12和15倍,9月份(开花后)则呈下降趋势。处于盛花期的青蒿在根、茎、叶、花各个组织中都能检测到青蒿素合成基因的表达,叶片中ADS基因mRNA水平较其他组织显著升高2倍左右(均P0.01),显示组织表达特异性。【结论】青蒿素生物合成基因的发育表达模式与青蒿素的合成规律一致。ADS和CYP71AV1基因的表达在青蒿素生物合成过程中可能起关键作用。