白蒺藜对光感受器细胞的抗炎、抗氧化保护效应机制研究

目的　探讨白蒺藜对光损伤诱导的光感受器细胞退行性改变的保护作用。方法　36只小鼠随机分为3组,每组各12只,采用10×10³ Lux白炽光光照30 min建立BALB/C小鼠视网膜光损伤模型,光照前30 min白蒺藜给药组腹腔注射白蒺藜水煎液100 μL,正常对照组和光损伤模型组腹腔注射等量生理盐水。光照后22 h,腹腔注射二氢乙锭,2 h后摘取眼球制备冰冻切片,观察视网膜原位氧化应激状态。分别于光照后6 h、24 h摘取视网膜组织,进行总RNA抽提、逆转录制备cDNA样品,通过实时荧光定量PCR分析小鼠视网膜炎症相关因子。检测白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、趋化因子CcL2（chemokine,Ccl2）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、细胞间黏附因子-1（intercellular cell adhesion molecules-1,ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）基因的mRNA表达水平。结果　光照24 h后,与正常对照组、白蒺藜给药组相比较,光损伤模型组视网膜色素上皮细胞及光感受器细胞氧化应激标志物呈显著阳性,差异均有统计学意义（均为P<0.001）。与正常对照组相比较,光损伤模型组视网膜IL-1β、Ccl2、COX-2、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达水平显著升高,差异均具有统计学意义（均为P<0.01）;与光损伤模型组相比,白蒺藜给药组视网膜IL-1β、Ccl2、COX-2、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达水平显著降低,差异均有统计学意义（均为P<0.01）。结论　在视网膜退行性病变模型中,白蒺藜表现出良好的光感受器细胞保护作用。抗氧化、抗炎可能是白蒺藜防治光感受器细胞损伤效应的相关机制之一。     

清肝益肾祛风方防治高血压心肌损伤的效应机制研究

目的探讨清肝益肾祛风方(QingganYishen Qufeng formula,QYQ)在高血压及高血压致心肌损伤双重病理条件下的干预效应及可能的作用机制。方法将自发性高血压大鼠随机分为模型组(SHR)、清肝益肾祛风方组(QYQ)、坎地沙坦组(Can),以8只同周龄雄性WKY大鼠作为正常对照组(WKY)。所有实验动物于6周龄起进行药物干预,共干预14周。各组大鼠均每隔2周通过尾压法测量收缩压及舒张压水平,以评价QYQ降压作用;20周龄时取心脏组织,石蜡包埋切片,HE染色计算心肌细胞横截面面积以评价QYQ对高血压心肌损伤的预防作用;同时进一步检测心脏组织中miR-125a-5p及其靶基因IL-6R、STAT3以及IL-6 mRNA的差异性表达。结果与模型组(SHR)比较,QYQ可显著降低SHR大鼠收缩压及舒张压水平(P0.05),减少心肌细胞横截面面积(P0.05),显著上调心脏组织中miR-125a-5p的表达,显著下调其直接靶基因IL-6R mRNA、STAT3 mRNA的表达,显著下调心脏组织中IL-6 mRNA的表达(P0.05)。结论 QYQ不仅具有显著的降压作用,且对高血压心肌损伤具有显著的预防作用;QYQ对miR-125a-5p/IL-6R/STAT3介导作用通路的调节作用可能是其防治高血压心肌损伤潜在的分子机制之一。     

石斛夜光丸光感受器细胞保护效应的研究

目的探讨石斛夜光丸抗光损伤诱导光感受器细胞退行性改变的效应。方法采用BALB/c小鼠,分为正常对照组、模型组以及石斛夜光丸不同时间点给药组。模型组及石斛夜光丸治疗组接受白炽光光照30 min[光照强度为(10 000±10)lx]以建立视网膜光损伤模型。石斛夜光丸治疗组连续给药7 d,光照前暗适应24 h,治疗组分别在光照前立即给药或光照前30 min给予石斛夜光丸水煎液200μl灌胃,正常对照组和模型组给予等量0.9%NaCl溶液灌胃。光照后7 d通过光学相干断层扫描(OCT)检测小鼠视网膜形态结构。采用石蜡切片进行苏木素-伊红(HE)染色和视紫红质(RHO)、中波敏感视蛋白(M-opsin)免疫组织化学染色,以进一步明确视网膜形态学及视杆细胞、视锥细胞的病理改变情况。结果正常对照组视网膜结构完整,RHO和M-opsin表达分布正常;与正常对照组相比,模型组外核层显著变薄,光感受器细胞外节层及内节层结构紊乱,RHO和M-opsin表达显著降低;与模型组相比,石斛夜光丸两给药组视网膜形态基本完整清晰,RHO和M-opsin的表达增多。结论石斛夜光丸具有显著的抗光损伤诱导的光感受器细胞退行性改变的作用。     

熟地黄抗光诱导的光感受器退行性病变效应研究

目的：采用光损伤小鼠模型,探究熟地黄对光感受器的保护效应。方法：25只雌性Balb/c小鼠,随机分为正常对照组,光损伤模型组,熟地黄低、中、高剂量组,各5只。光损伤模型组及熟地黄各剂量组接受（15 000±10）lux白光光照30 min进行造模。通过结构、形态、功能以及分子病理等方面,评价熟地黄的光感受器保护作用。结果：OCT和HE染色结果表明,熟地黄呈剂量依赖性显著保护光损伤小鼠视网膜结构（P<0.05）;ERG分析结果表明,熟地黄可显著保护光损伤小鼠视网膜功能（P<0.05）;免疫组织化学分析结果表明,熟地黄可显著保护光感受器一级神经元及二级神经元结构并抑制Müller细胞反应性增生（P<0.05）。结论：熟地黄可显著抑制光损伤诱导的光感受器退行性改变及相关视网膜二级神经元损伤,同时对Müller细胞反应性异常增生具有显著的抑制作用。     

杞菊地黄丸联合美托洛尔光感受器细胞保护及视网膜重塑相关研究＊

目的 本实验采用光损伤小鼠模型，探讨杞菊地黄丸联合美托洛尔的光感受器细胞保护效应及视网膜重塑相关机制。方法 采用BALB/c小鼠，随机分为正常对照组、光损伤模型组、美托洛尔治疗组、杞菊地黄丸治疗组及杞菊地黄丸联合美托洛尔治疗组，给药一周后进行24 h暗适应，末次给药后15 min以10 000 lux白光光照30 min对小鼠进行造模，3天后采用视网膜电图（electroretinogram,ERG）进行视网膜功能分析，7 d后采用光学相干断层扫描（optical coherence tomography,OCT）对视网膜结构进行分析并测量视网膜外核层（outer nuclear layer,ONL）厚度，最后进行眼球取材、切片、病理学及免疫组织化学分析进一步明确各组视网膜光感受器细胞、双极细胞、水平细胞及Müller细胞病理改变情况。结果 （1）OCT、ONL厚度及HE染色分析结果表明，与正常对照组完整的视网膜形态及ONL厚度相比较，光损伤模型组小鼠视网膜ONL结构受损严重，ONL厚度显著降低（P < P < 0.05）；与光损伤模型组相比较，美托洛尔及杞菊地黄丸治疗组均存在不同程度的视网膜ONL结构破坏，其中美托洛尔给药组视网膜ONL形态与光损伤模型组结果相似，杞菊地黄丸治疗组视网膜尚可见视网膜ONL结构层次，ONL厚度测量结果表明美托洛尔与杞菊地黄丸给药组ONL厚度较模型组显著增加（P < P < 0.05）；与光损伤模型组和美托洛尔治疗组及杞菊地黄丸治疗组相比，杞菊地黄丸联合美托洛尔给药组小鼠视网膜结构清晰，ONL厚度显著增加（P < 0.05）。（2）ERG分析结果表明，正常对照组小鼠视网膜电图a波及b波振幅随着刺激增强而上升；与正常对照组相比较，光损伤模型组小鼠a波及b波振幅显著降低（P < 0.05）；与光损伤模型组相比，美托洛尔治疗组小鼠视功能未见改善，杞菊地黄丸组小鼠视网膜电流图振幅增加（P < 0.05）；与光损伤模型组和美托洛尔治疗组及杞菊地黄丸治疗组相比较，杞菊地黄丸联合美托洛尔治疗组a波及b波振幅显著增加（P < 0.05）。（3）免疫组织化学分析结果表明，正常对照组小鼠视网膜光感受器细胞外节视紫红质（rhodopsin,RHO）和中波敏感视蛋白（mid-wavelength sensitive cone opsin,M-opsin），双极细胞标志蛋白激酶Cα（protein kinase Cα,PKCα），水平细胞标志蛋白钙结合蛋白D（Calbindin D）以及Müller细胞标志蛋白胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫阳性正常；与正常对照组相比较，光损伤模型组小鼠视网膜上述神经元标志蛋白免疫阳性染色显著减弱甚至消失，GFAP表达模式异常，提示胶质异常增生；与光损伤模型组相比较，美托洛尔治疗组上述视网膜神经元免疫阳性并无差异，杞菊地黄丸治疗组视网膜双极细胞和水平细胞免疫阳性显著增强，但光感受器细胞标志蛋白和Müller细胞免疫阳性并无差异；与模型组及美托洛尔治疗组和杞菊地黄丸治疗组相比较，杞菊地黄丸联合美托洛尔治疗组视网膜光感受器细胞、双极细胞、水平细胞标志蛋白免疫阳性显著增强，GFAP免疫阳性减弱。结论 杞菊地黄丸联合美托洛尔干预对光感受器细胞结构及功能具有显著的保护效应，可能与其促进视网膜修复性重塑相关。     

三七总皂苷对新生血管性视网膜病变的干预效应及机制研究＊

目的探讨三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)对视网膜新生血管性病变进程中视网膜神经血管单元病理改变的干预效应和机制,为三七及三七皂苷制剂临床应用于相关视网膜病变的治疗提供部分实验和理论依据。方法本课题采用氧诱导视网膜病变(Oxygen induced retinopathy,OIR)小鼠模型,将7天龄(Postnatal 7,P7)C57/BL6J小鼠根据体质量随机分为正常对照组(NC组),OIR模型组(OIR组)和PNS治疗组(PNS组),造模后从P12开始腹腔注射给药,根据不同的实验内容调整给药天数。于P7、P12、P19、P26和P33测量小鼠的体质量,于P19和P33应用小动物视网膜成像显微镜活体采集视网膜及血管图像,并定量分析;于P33应用全视网膜眼电图Ganzfeld ERG系统进行小鼠视网膜电图波形采集,对a波和b波振幅进行分析;于P46和P66将小鼠处死,取眼球制作眼杯,冰冻切片后进行胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫组织化学分析;于P13和P15处死小鼠,取视网膜组织,采用Real-time PCR分析各组视网膜抗血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、血管内皮细胞钙粘蛋白(Vascular endothelial-cadherin,VE-cadherin)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL^-1β)的mRNA表达水平。结果(1)NC组、OIR组和PNS组的小鼠在生长发育中不同天龄的体质量无统计学差异(P>0.05)。(2)P19 OIR组小鼠视网膜血管荧光素钠渗漏面积显著大于NC组(P<0.05),而PNS组渗漏面积显著小于OIR组(P<0.05)。(3)P33 OIR组小鼠视网膜动脉迂曲指数(Retinal artery tortuosity index,RAT index)显著大于NC组(P<0.05),而PNS组显著小于OIR组(P<0.05)。(4)OIR组小鼠b波振幅与NC组相比有统计学差异(P<0.05);PNS组b波振幅与OIR组相比有统计学差异(P<0.05)。(5)P46和P66 OIR组小鼠视网膜Müller细胞GFAP免疫阳性明显增强,并可达内核层和外核层,PNS组GFAP免疫阳性和NC组相近,未见GFAP的免疫阳性异常。(6)P13和P15 OIR组小鼠视网膜中,PNS对VEGFA和IL^-1β的mRNA水平无明显干预作用(P>0.05),但可显著上调VE-cadherin mRNA水平(P<0.05),显著下调TNF-αmRNA水平(P<0.05)。结论PNS对缺氧诱导的视网膜病变相关神经血管单元异常具有一定的干预效应,可能与其显著上调视网膜VE-cadherin的表达水平,下调TNF-α的表达水平有关。     

不同周龄ApoE-/-雄性小鼠离体胸主动脉内皮依赖性舒张作用研究

目的:研究不同周龄ApoE~(-/-)雄性小鼠离体胸主动脉内皮依赖性舒张功能的变化。方法:采用不同周龄(18~44周)ApoE~(-/-)雄性小鼠,分离其胸主动脉,以不同浓度的乙酰胆碱(Ach)分别评价其内皮的完整性,并绘制浓度-舒张曲线,观察不同周龄ApoE~(-/-)小鼠胸主动脉内皮的依赖性舒张作用;胸主动脉行油红O染色,以评价不同周龄ApoE~(-/-)小鼠胸主动脉脂质沉积、斑块面积大小。结果:不同周龄ApoE~(-/-)小鼠离体胸主动脉在浓度为10-5mol/L的Ach作用下,其舒张率均80%,且随着周龄的增加,舒张率呈逐渐降低趋势;与24周相比,48周ApoE~(-/-)雄性小鼠离体胸主动脉在不同浓度Ach下,其舒张率均显著降低;与24周和36周ApoE~(-/-)小鼠相比,48周ApoE~(-/-)小鼠其斑块面积/血管剖面面积显著增加。不同周龄ApoE~(-/-)小鼠血清中总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)差异均无统计学意义(P0.05)。ApoE~(-/-)雄性小鼠胸主动脉内皮完整性、血管舒张功能与周龄呈负相关关系(P0.05),同时与脂质沉积、斑块面积也呈负相关关系(P0.05)。结论:ApoE~(-/-)雄性小鼠血管内皮依赖性舒张率随着周龄及斑块面积/血管剖面面积的增加而降低,其胸主动脉血管内皮依赖性舒张功能与周龄、斑块面积/血管剖面面积呈负相关关系。     

木樨草素-7-二葡萄糖醛苷抗异丙肾上腺素诱导心肌损伤作用研究

目的:探索木樨草素-7-二葡萄糖醛酸苷(luteolin-7-diglucuronide,L7DG)通过口服干预,抗异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)所诱导心肌损伤的作用,为进一步临床应用提供有力的实验依据。方法:以10 mg·kg~(-1)的ISO持续腹腔注射5d,模拟C57BL/6雄性小鼠心肌损伤模型。于每次ISO腹腔注射前30 min分别给予L7DG两种剂量口服干预,即L7DG低剂量(120 mg·kg~(-1))与L7DG高剂量(240 mg·kg~(-1))。分别通过HE染色及Masson's染色,评价L7DG抗ISO所诱导的心肌损伤、心肌肥大以及纤维化的作用。结果:HE染色结果提示,与模型组相比,L7DG高剂量组与低剂量组炎性细胞浸润均显著降低(P 0. 05),此外,L7DG高剂量组与低剂量组均未见ISO诱导的左心室扩张性改变; Masson's染色结果提示,与模型组相比,L7DG高剂量组与低剂量组心肌纤维化沉积均显著降低(P 0. 05);与正常组相比,模型组左心室心肌横截面积显著增大(P 0. 05);而与模型组相比,L7DG高剂量组与低剂量组左心室心肌细胞横截面积均显著降低(P 0. 05)。结论:口服L7DG可显著减低ISO所诱导小鼠心肌损伤、纤维化、心肌细胞肥大的程度并改善左心室扩张性改变,这将为L7DG进一步应用于相关心血管疾病的治疗提供有力的临床支撑。     

白蒺藜抗光损伤小鼠光感受器细胞凋亡及保护视网膜功能的研究

目的探讨白蒺藜对光损伤小鼠光感受器细胞凋亡及受损视网膜功能的影响。方法 BALB/c小鼠随机分为正常对照组、光损伤模型组、白蒺藜给药组。暗适应24 h后,白蒺藜给药组腹腔注射白蒺藜水煎液100μl(每20 g体质量100 mg生药),给药后30 min进行光照造模。造模采用白色荧光灯,光强度为10 000 lux,持续照射30 min。正常对照组和光损伤模型组同时腹腔注射等量0.9%NaCl溶液。(1)光照1 d、3 d后,摘取眼球制备冰冻切片,采用TUNEL法标记凋亡的光感受器细胞。(2)光照6 d后采用视网膜电流图(ERG)检测小鼠视网膜功能。结果 (1)TUNEL结果显示,正常对照组的外核层光感受器细胞核TUNEL染色为阴性。与正常对照组比较,光损伤后模型组小鼠的视网膜外核层TUNEL阳性光感受器在1 d开始显著增加,3 d达到高峰(P0.001);与光损伤模型组比较,白蒺藜给药组外核层仅见少量散在的TUNEL阳性光感受器细胞(P0.05)。(2)ERG结果显示,与正常对照组比较,光损伤模型组小鼠视网膜a波、b波振幅显著降低(P0.05),白蒺藜给药组a波、b波振幅显著高于模型组(P0.05)。结论白蒺藜能显著地减轻光损伤引起的光感受器细胞凋亡,对光损伤小鼠视网膜功能具有保护作用。