miR-198 通过靶向ZEB2 调控EMT 过程抑制肝癌细胞增殖和迁移的机制研究

目的 探讨微小核糖核酸-198（miR-198）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织细胞中的表达及其对癌细胞增殖、迁移的影响及其相关机制。方法 采用qRT-PCR 检测miR-198 在HCC 组织及细胞(HepG2,Hep3G,MHCC97H,Huh7) 中的表达情况;采用脂质体2000 向Huh7 细胞中单独转染miR-198 mimics,共转染miR-198 mimics 和pcDNA3.1-ZEB2;生物信息学网站预测miR-198 的潜在靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验进行验证;采用Western blot 检测E 盒结合锌指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2, ZEB2）及上皮-间质转化（epithelialmesenchymaltransformation, EMT）相关蛋白表达;CCK-8 法和细胞划痕实验检测Huh7 细胞增殖和迁移能力。结果 20 例HCC 组织中miR-198相对表达量（0.354±0.022）明显低于邻近正常组织（4.762±1.135）,差异有统计学意义（t=17.365,P＜ 0.001）。HCC细胞系HepG2（0.589±0.103）,Hep3G（0.495±0.086）,MHCC97H（0.558±0.056）和Huh7（0.362±0.045）中miR-198 相对表达量较正常肝细胞LO2（1.823±0.125）显著降低（t=17.159,18.466,17.590,20.315,均P ＜ 0.05）。miR-198 mimics 组细胞增殖（0.398±0.146 vs 0.691±0.213）和迁移能力（20.012±2.103 vs 84.032±6.512）较对照组明显降低（t=1.965,52.459,均P ＜ 0.001）。miR-198 mimics 组细胞中E-cadherin 表达较对照组明显升高,N-cadherin和Vimentin 表达较对照组明显降低（t=18.478,17.550,19.706,均P ＜ 0.01）。ZEB2 是miR-198 的靶基因,miR-198负调控ZEB2。20 例HCC 组织中ZEB2 相对表达量（3.621±1.143）明显高于邻近正常组织（ 0.736±0.030）,差异有统计学意义（t=11.284,P ＜ 0.001）,与miR-198 表达呈负相关（r=-0.702,P ＜ 0.05）。共转染过表达ZEB2 逆转了miR-198 mimics 对HCC 细胞增殖、迁移和EMT 的抑制作用。结论 miR-198 在HCC 组织和细胞中表达下调,miR-198 通过靶向负调控ZEB2 的表达抑制Huh7 细胞的增殖和迁移。     

大鼠血管平滑肌Caveolin-1 与TRPC1 相互作用及其在肺动脉高压中的变化

【立论依据】 业已证明,经典瞬时感受器电位1(TRPC1)通道蛋白编码的钙池操纵性钙通道(SOCC)表达上调和功能增强与肺血管增生、重构,以及肺高压密切相关,TRPC1/SOCC 存在于胞膜窖上。Caveolin-1(Cav1)是胞膜窖的主要结构蛋白,野百合碱肺高压模型大鼠和原发性肺动脉高压患者的肺血管平滑肌细胞胞膜窖分布密度和Cav1 表达都显著增加。 【设计思路与实验内容】 在对照(CON)组和慢性低氧肺高压(CH)组大鼠,采用透射电镜、定量RT-PCR 等技术和蛋白质印迹技术,观察主动脉和肺动脉主动脉上观察胞膜窖分布密度及Cav1 表达变化;此外观察胞膜窖结构被破坏后、环匹阿尼酸(CPA)、苯肾上腺素(PHEN)、内皮素-1(ET-1)和KCl 所引起的肺动脉和主动脉张力的不同变化,以明确胞膜窖的结构完整与血管平滑肌张力变化之间的关系,进一步分析这种关系在肺循环和体循环之间的异同。 【材料】 SD 大鼠、8 通道信号采集系统、定量PCR 仪、透射电镜,以及CPA、PHEN、ET-1 和MCD 等试剂。 【可行性】 已掌握完成本实验所需的技术、本项目2013 年获得国家级大学生创新训练项目资助。血管环张力实验获得初步结果:(1)两组MCD 预处理均抑制PHEN 引起主动脉张力,但是对KCl 引起的主动脉张力无抑制作用,与CON 组比较,在CH 组MCD 预处理抑制作用无进一步增强。(2)两组MCD 预处理均抑制对PHEN 引起的肺动脉张力,但对KCl 引起的肺动脉张力也无抑制作用,与CON 组比较,在CH 组MCD 预处理抑制作用也无进一步增强。提示,电压依赖性钙通道不依赖于胞膜窖的完整性,PHEN 介导的血管收缩可能依赖于胞膜窖的完整性,但慢性低氧预处理对这一过程没有影响。 【创新性】 本课题预期结果:(1)在正常大鼠上,肺动脉与主动脉上均存在胞膜窖分布密度和Cav1 表达,并对血管张力产生影响。(2)在CH 大鼠上,肺动脉胞膜窖分布密度和Cav1表达,以及血管张力的变化,可能与主动脉存在不同。本课题试图阐明肺循环与体循环血管TRPC1/SOCC 与胞膜窖(Cav1)的关系,探索慢性低氧肺高压发病过程中,肺循环与体循环血管张力变化和TRPC1/SOCC 调控的不同特点,为寻找治疗肺高压的新靶点提供理论依据。     

胆碱和甜菜碱与中老年人认知功能的关系

目的 综述胆碱和甜菜碱对中老年人认知功能的作用。方法 计算机检索CochraneLibrary、PubMed、MEDLINE、中国知网和万方数据库在2000～2020年间发表的胆碱和甜菜碱对中老年人认知功能影响的相关文献,包括与人群相关的系统综述和Meta分析、随机对照试验和观察性研究。结果 从检索到的2794篇文献中,共筛选出16篇符合纳入标准的文献。（1）膳食胆碱和磷脂酰胆碱摄入量增加有益于维护中老年人的认知功能,但没有观察到它们对痴呆患者的认知功能有改善作用;甜菜碱干预可改善阿尔茨海默病患者的认知功能。（2）血中较高水平的胆碱、甜菜碱与老年人较好的认知功能有关。（3）胆碱代谢物胞二磷胆碱（CDP-胆碱）作为药物干预,能改善脑血管病和卒中患者以及有轻度认知功能障碍中老年人的认知功能,但没有发现CDP-胆碱可改善血管性痴呆患者的认知功能。结论 胆碱、磷脂酰胆碱、甜菜碱和CDP-胆碱摄入有益于维护中老年人的认知功能,但循环中胆碱和甜菜碱水平对认知功能的影响尚无一致结论。[营养学报,2022,44(2):138-143]     

某儿童成长配方奶粉对微量营养素不足饲料喂养大鼠生长发育、骨量及钙吸收的影响

目的 探讨采用儿童成长配方奶粉（以下简称配方奶粉）进行营养加强或营养补充后,对大鼠生长发育及骨密度等指标的影响。方法 断乳SD大鼠雌雄各半62只随机分成3组,分别饲以微量营养素不足饲料、营养素加强饲料、营养素补充饲料,监测大鼠身长和体重,8周后进行钙吸收实验。12周后测定全身、脊柱、四肢骨密度（BMD）和骨矿量（BMC）。结果 与营养素不足组相比,营养素加强组及营养素补充组雌性大鼠体重增长加快（均P<0.05）,全身、脊柱与四肢BMD增加（均P<0.05）,全身及四肢BMC增加（均P<0.05）,营养素补充组雌性大鼠身长增长加快（P<0.05）;与营养素不足组相比,营养素补充组雄性体重及身长增长加快（均P<0.05）,营养素加强组及营养素补充组雄性大鼠全身、脊柱及四肢BMD增加（均P<0.05）,全身及四肢BMC增加（均P<0.05）,营养素补充组雄性大鼠脊柱BMC增加（P<0.05）。与营养素不足组相比,营养素加强组及营养素补充组雌雄大鼠钙吸收率上升（均P<0.05）。与营养素加强组相比,营养素补充组雄性大鼠体重、身长增长加快,全身BMC及四肢BMD和BMC增加（均P<0.05）。结论 配方奶粉强化AIN-93G饲料或在微量营养素不足饲料中添加配方奶粉对营养素不良饲料喂养的大鼠其身长、体重、BMD、BMC及钙吸收率均有所改善。且在雄性大鼠中,在微量营养素不足饲料中添加配方奶粉可实现对强化饲料在体重增长、BMD、BMC等方面的追赶。     

大黄?虫丸全方及君药药对中主要药效成分的定性定量研究

目的 借助高效液相色谱分析技术,利用中药复方拆方的研究思路,比较分析大黄虫丸全方及大黄、土鳖虫药对中药效成分变化。方法 色谱柱为Thermo Hypersil Gold;流动相0.1%甲酸水-甲醇,梯度洗脱;柱温:30 ℃;检测波长270 nm,建立大黄虫丸及其君药药对指纹图谱,定量分析君药大黄中蒽醌类成分以及土鳖虫中次黄嘌呤含量。结果 分别建立大黄虫丸全方及药对的液相指纹图谱,全方共鉴定了32个共有峰,药对鉴定了27个。在定量研究中,我们发现药对中5种大黄蒽醌的含量均比全方高,其中芦荟大黄素1.6倍,大黄酸1.48倍,大黄素2.23倍,大黄酚2.43倍,大黄素甲醚2.48倍,次黄嘌呤含量较全方低。结论 大黄虫丸全方及药对均具有抗肝癌作用,虽然药对中大黄蒽醌类成分较全方高,但抗肝癌作用临床上以全方为优,提示全方低剂量多成分、多靶点作用的重要性。对大黄虫丸中蒽醌类以及动物药中次黄嘌呤含量的测定提供了参考,也为后期进一步探索全方抗肝癌物质基础提供思路。      

Toll样受体4与髓样细胞触发受体1在脓毒症的诊断中研究现状

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合症,其发病率、死亡率都很高,目前仍是临床危重症患者死亡的主要原因之一。对脓毒症的早期诊断尤为重要,本文就Toll样受体4及髓样细胞触发受体1在脓毒症诊断中的研究做一综述。     

脓毒症患者血清中TLR-4、TREM-1、sCD14和IL-18的变化

目的探讨脓毒症患者血清TLR-4、TREM-1、sCD14和IL-18含量的变化与脓毒症严重程度的相关性及用于诊断脓毒症的敏感度与特异度。方法选取60例脓毒症患者及30例正常体检者,分别抽血采用酶联免疫法(ELISA法)测TLR-4、TREM-1、sCD14和IL-18的含量。脓毒症患者根据当天进行APACHE-Ⅱ评分结果,按评分≥20分和20分进入高评分及低评分脓毒症组。结果脓毒症患者上述各因子的含量治疗前均明显高于治疗后,并高于正常对照组(p值均0.05),并且与APACHE-Ⅱ评分呈正相关(r=0.651、0.662、0.652、0.668,P均0.05)。治疗前高评分脓毒症组血清中TLR-4、TREM-1、sCD14、IL-18的含量均明显高于低评分脓毒症组(P均0.05);脓毒症患者治疗前血清中上述细胞因子的ROC曲线下面积分别为1.000、0.795、0.828、0.834及0.850,APACHE-Ⅱ、TLR4、TREM-1及sCD-14分别取20、25.8 ng/ml、89.6 ng/ml及75 ng/ml为截断点,评价预后敏感性分别为为99%、82%、82%及91%,特异性分别为为100%、52%、66%及72%。结论脓毒症患者血清中TLR-4、TREM-1、sCD14、IL-18的含量与脓毒症的发生发展关系密切;通过监测上述细胞因子的含量可以对脓毒症病情严重程度做出一定的判断;TREM-1有可能成为诊断脓毒症较好的实验室指标之一,sCDl4有望成为较为敏感的脓毒症诊断标志物之一。     

GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡和氧化应激的影响及作用机制探讨

目的　通过检测G蛋白偶联受体家族C群5成员A（G protein coupled receptor C type group 5 member A, GPRC5A）在肝癌组织及细胞中的表达,探讨GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡、氧化应激的影响及其相关作用机制。方法　收集2018年12月～2019年11月在解放军联勤保障部队第九六九医院行手术治疗的38例肝癌患者癌组织及配对癌旁正常组织样本;另选取人正常肝上皮细胞株HL-7702和人肝癌细胞株（HepG2,HCCLM3,HuH-7和MHCC-97H）进行研究。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测肝癌组织、癌旁正常组织及肝癌细胞、正常肝上皮细胞中GPRC5A表达量。通过转染pcDNA3.1-GPRC5A质粒构建过表达GPRC5A肝癌细胞株,采用MTT实验和V-FITC/PI凋亡试剂盒分别检测过表达GPRC5A对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。采用活性氧指示剂DCFH-DA检测细胞中氧化应激相关因子活性氧（ROS）,NAD+/NADH和三磷酸腺苷（ATP）水平。采用Western blot实验检测凋亡相关蛋白caspase-3及上皮生长因子（VEGF）蛋白表达水平。结果　肝癌组织中GPRC5A表达较癌旁正常组织显著降低（0.34±0.09 vs 0.73±0.10）,差异有统计学意义（t=17.869,P<0.01）。肝癌细胞HepG2（0.35±0.06）,HCCLM3（0.38±0.10）,HuH-7（0.53±0.07）,MHCC-97H（0.67±0.06）中GPRC5A表达量显著低于人正常肝上皮细胞HL-7702中的GPRC5A表达量（1.00±0.08）,差异有统计学意义（t=5.716~11.258, 均P<0.05）。pcDNA3.1-GPRC5A组转染36 h细胞增殖吸光度（A）值（0.94±0.16）显著低于对照组（1.49±0.05）和pcDNA3.1组（1.45±0.07）（F=25.640,P<0.01）。GPRC5A过表达组VEGF（0.98±0.04）表达量较对照组（2.94±0.15）和pcDNA3.1组（2.89±0.11）显著降低（F=310.450,P<0.001）。pcDNA3.1-GPRC5A组细胞中ROS（182.12±13.42）水平显著高于对照组（101.23±11.20）和pcDNA3.1组（98.30±10.26）（F=49.577,P<0.001）;NAD+/NADH（35.24±6.43）及ATP（55.34±6.51）水平显著低于对照组（100.25±12.41,100.17±14.36）和pcDNA3.1组（97.86±9.67,102.23±11.02）（F=42.338,17.077,P<0.05）。GPRC5A过表达组细胞凋亡率高于对照组和pcDNA3.1组;细胞凋亡蛋白caspase-3（2.61±0.16）表达量也高于对照组（1.00±0.11）和pcDNA3.1组（1.01±0.02）（F=202.843,P<0.001）。pcDNA3.1-GPRC5A组细胞中p-STAT3表达量（0.43±0.06）显著低于对照组（1.00±0.13）和pcDNA3.1组（1.03±0.12）（F=29.476,P<0.001）;pcDNA3.1-GPRC5A组下游基因Socs3（0.47±0.05）,c-MYC（0.54±0.06）表达量也显著低于对照组（1.01±0.05,1.00±0.04）和pcDNA3.1组（0.98±0.09,1.02±0.06）（F=63.275,75.409,P<0.001）。肝癌组织中STAT3与GPRC5A表达量呈显著负相关（r=-0.746,P<0.01）。过转染pcDNA3.1-STAT3或pcDNA3.1-NLRP3后显著逆转了pcDNA3.1-GPRC5A对肝癌细胞的抑制作用（P<0.05）。结论　GPRC5A低表达可能通过调节STAT3/Socs3/c-MYC信号和炎症反应抑制了肝癌细胞的增殖,诱导肝癌细胞的氧化应激和凋亡。     

PKA信号通路通过CREB正性调控USP22基因的转录激活

【目的】 通过对原癌基因USP22的5'端启动子活性分析,获得 PKA信号通路调控USP22转录激活的直接证据并探索其中机制。 【方法】 克隆USP22基因5'端核心启动子,定向插入荧光素酶报告载体pGL3-Basic;重组质粒经脂质体转染人宫颈癌HeLa细胞12 h后,分别采用PKA信号的激动剂Forkslin和抑制剂H-89刺激;双萤光素酶实验分析USP22启动子片段的相对活性;在此基础上,利用real-time PCR检测Forkslin和H-89对内源性USP22表达影响,以获得PKA信号通路调控USP22转录激活的直接证据;采用DNA定点突变技术,剔除该启动子区一个典型的CREB/ATF结合位点,经Forkslin和H-89处理,双萤光素酶检测以证实PKA信号通路通过CREB/ATF反应元件调控USP22的转录;最后,联合染色质免疫共沉淀(ChIP)与real-time PCR实验观察H-89对转录因子CREB与USP22启动子结合能力的影响。 【结果】 USP22基因的启动子活性及内源性mRNA表达受到PKA通路抑制剂H-89的显著抑制,但并未因为PKA的激活而出现明显上调;破坏CREB/ATF结合位点可消除USP22启动子对H-89的反应性;H-89抑制CREB与USP22启动子中CREB/ATF反应元件的结合导致USP22转录活性的下降。 【结论】 CREB/ATF结合位点控制着USP22基因的常规表达;USP22的转录受到PKA信号通路的正性调控;PKA信号通路通过转录因子CREB实现上述功能。     

LPS、IL-23对脓毒症患者PBMCs产生IFN-γ的作用

目的应用脓毒症患者外周血单个核细胞与LPS及IL-23共培养诱导干扰素-γ表达,探讨脓毒症单个核细胞免疫状态的改变。方法选取35例脓毒症患者作为脓毒症组,31例全身炎症反应综合征(SIRS)患者为SIRS组,17例健康对照者为对照组,取外周血浆分离单个核细胞(PBMCs),分别与LPS、IL-23及LPS+IL-23共同培养,72h后用ELISA法检测培养上清中IFN-γ的水平。结果 LPS、IL-23及LPS+IL-23与PBMCs细胞共同培养后,正常组可诱导PBMCs产生大量IFN-γ,脓毒症组和SIRS组与正常组相比IFN-γ的产生明显减少(p均0.05)。结论脓毒症患者单个核细胞IFN-γ释放能力明显下降,表明脓毒症患者免疫状态受到抑制。