无细胞M.Smegmatis 菌苗的研究与应用

结核病是世界卫生组织(WHO)公布的危害人类健康的十大疾病之一.我国目前同样面临结核病的严峻挑战,2000年全国结核病流行病学调查结果表明,我国目前有近半人口(约5.5亿)感染了结核菌,其中有5000多万人为结核菌素实验强反应者(硬结直径≥15m或有水泡、坏死),因其结核发病率极高,被称为结核感染高危人群.如何控制这些人潜在的内源性复发、外源性再感染和发病,是结核病控制的重点.     

结核抗体检测试剂盒用血清标准品的制备及应用

目的 结核抗体检测试剂盒质量控制用血清标准品的制备及应用。方法 采集结核病患者和健康人血清，用ELISA法进行检测，制备血清标准品：包括10份检测结果为阳性的结核病患者血清、10份检测结果为阴性的健康人血清、1份检测结果为强阳性的结核病患者血清用健康人血清进行倍比稀释而成的5个稀释浓度；并对血清标准品进行稳定性试验；同时用本套血清标准品对不同厂家生产的结核抗体检测试剂盒以及同一厂家生产的不同批号的结核抗体检测试剂盒进行测定。结果 本血清标准品具有良好的稳定性;不同厂家生产的结核抗体检测试剂盒质量不均一，同一厂家生产的试剂盒质量也不均一。结论 本血清标准品可以用于结核抗体检测试剂盒的质量控制；各生产厂家要严格按照生产工艺的SOP进行生产，把好质量关。     

新型布鲁氏菌皮肤变态反应制剂的效果评价

利用三氯醋酸和硫酸铵综合法提取制备纯化的布鲁氏菌纯蛋白变应原 ,同时采用现行市售布鲁氏菌素进行对比研究 ,对相关人群做布鲁氏菌皮内变态反应实验。结果表明该制品具有良好的皮肤变态反应原性 ,其特异性及敏感性均优于现行市售菌素 ,可做为一种新型布氏菌病诊断制剂应用于实验研究及现场调查研究。     

结核分枝杆菌潜伏感染豚鼠模型的建立

目的 建立MTB潜伏感染豚鼠模型,研究MTB体内增殖动力学及与PPD试验的关系.方法 62只豚鼠按随机数字表法分成对照组(20只)和模型组(42只),模型组又分为4周组(12只)、8周组(21只)和12周组(9只).采用恢复毒力的H37Rv株500 CFU经豚鼠腹股沟皮下注射攻毒,攻毒后2周,模型组给予异烟肼(10 mg/kg)和吡嗪酰胺(40 mg/kg)每周3次灌胃,控制MTB增殖,分别于4周、8周和12周停药.模型4周组停药后观察结核病自然复发情况,模型8周组和12周组停药后观察结核病自然复发和地塞米松诱导复发情况.在建立模型过程中进行PPD试验,检测豚鼠的脾、肺荷菌量及组织切片病理,分析PPD试验与结核病活动或潜伏感染的关系.结果 对照组豚鼠攻毒后2周脾荷菌量为3.3 lgCFU,6周后出现腹股沟淋巴结肿大,脾、肺荷菌量分别为4.5和1.8 lg CFU,18周时脾、肺荷菌量分别达5.3和5.4 lg CFU.观察期间,模型4周组停药后结核病均自然复发;模型8周组有结核病自然复发和地塞米松诱导复发;模型12周组无结核病自然复发,但地塞米松可诱导结核病复发.PPD试验反应越强,结核病越容易复发,PPD试验反应阴性豚鼠则无结核病复发.结论 H37Rv攻毒豚鼠后,用异烟肼和吡嗪酰胺联合化疗可抑制MTB增殖,成功建立豚鼠MTB潜伏感染模型,潜伏感染可致豚鼠结核病的自然复发或地塞米松诱导复发.PPD试验反应强弱与结核病复发有关.     

结核分枝杆菌H37Rv两种抗原Ag85b、HspX的制备及其与佐剂的联合应用

目的 用分子生物学方法制备H37Rv的两种抗原Ag85b、HspX,通过与铝佐剂和CpG佐剂联用免疫小鼠进行初步药理学实验以观察其生物学活性.方法 常规方法分别构建重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,内切酶鉴定目的 片段后两种质粒分别转化BL-21大肠杆菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后分别产生两种蛋白;用阴离子交换柱Source30、QHP以及疏水层析柱对两种蛋白进行纯化;蛋白测序进行鉴定.纯化后的两种蛋白分别与铝佐剂和CpG佐剂联用(Ag85b,Ag85b+Al,Ag85b+CpG,Ag85b+Al+CpG;HspX,HspX+Al,HspX+CpG,HspX+Al+CpG),免疫C57/BL小鼠,同时设置生理盐水对照组,取脾细胞进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测干扰素-γ(IFN-γ)的分泌;同时进行淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞经体外刺激后的增殖情况.结果 成功构建了两种重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,成功诱导表达了两种蛋白;经过纯化,两种蛋白纯度均达到95%;经鉴定两种蛋白纯化产物的N端15个氨基酸序列与目的序列相同;Ag85b+CpG、Ag85b+Al和Ag85b+CpG+Al组经Ag85b(80 μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05);HspX+CpG+Al组经HspX(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05).结论 成功表达并纯化了结核分枝杆菌H37Rv的两种抗原Ag85b和HspX,与铝佐剂和CpG佐剂联用后成功刺激小鼠产生了细胞免疫反应,证实了两种重组蛋白的生物学活性,为下一步药效学评估奠定了基础.     

组织胞浆菌病和结核病的实验室诊断

组织胞浆菌病（HP）是由荚膜组织胞浆菌（HC）引起的一种传染性很强的系统性深部真菌病,常由呼吸道传染.该病临床表现多样,分为无症状型、急性肺型、播散型以及慢性肺型,极易误诊为结核、肺炎、结节病、败血症等.慢性肺型其临床表现为发热、咳嗽、多痰、咯血、胸痛、呼吸困难、盗汗、消瘦,X线胸片常呈边缘清楚的肺实变,长期则为结节状影,部分患者在肺尖部形成空洞,这些表现很难与结核病区别.我国结核病患者中2/3的细菌学检查为阴性,主要根据临床体征与X线胸片来确诊,这些患者中部分可能系HP或同时患有两种疾病,因而实验室鉴别诊断尤为重要.     

我国卡介苗保护力评价参考体系建立的探讨

目的 探讨我国结核病新疫苗评价用卡介苗参考体系对豚鼠的保护力。 方法 采用我国卡介苗（D₂ PB 302）菌株制备的疫苗,以1/10人用剂量（0.005 mg/0.2 ml）经皮下注射免疫豚鼠,对照组等体积注射生理盐水。共进行4个实验,免疫与感染间隔分别为：实验Ⅰ与Ⅱ免疫后进行Mtb感染的时间间隔为5周（其中实验Ⅱ为实验Ⅰ的重复实验,实验Ⅰ中BCG组和对照组均入组8只豚鼠;实验Ⅱ中BCG组入组6只豚鼠,对照组入组8只豚鼠）,实验Ⅲ为28周（BCG组入组5只豚鼠,对照组入组6只豚鼠）,实验Ⅳ为60周（BCG组和对照组均入组8只豚鼠）,感染剂量为每只豚鼠2×（10²～10³）CFU Mtb/ml,注射0.5 ml,感染途径为皮下注射,感染后6周,进行豚鼠解剖,观察豚鼠肝脾肺的病变程度并进行脾脏Mtb的分离,计算脾脏Mtb分离数和对数值。 结果（1） BCG免疫5周组,豚鼠的肝脾肺综合病变指数为10.0±3.8,较对照组（46.9±4.8）差异有显著统计学意义（t=-0.63, P<0.01）;脾脏Mtb分离数的对数值(lg)为0.49±0.49,较对照组（5.41±0.18）差异有显著统计学意义（t=-9.43, P<0.01）。（2）BCG免疫5周重复实验组,豚鼠的肝脾肺综合病变指数为6.7±2.1,较对照组（36.3±6.0）差异有显著统计学意义（t=-4.63, P<0.01）;脾脏Mtb分离数的对数值(lg)为0.38±0.38,较对照组（5.11±0.19）差异有显著统计学意义（t=-11.22, P<0.01）。（3）BCG免疫28周组,豚鼠的肝脾肺综合病变指数为10.0±4.5,较对照组（57.5±6.2）差异有显著统计学意义（t=-6.24, P<0.01）;脾脏Mtb分离数的对数值(lg)为2.16±0.93,较对照组（5.44±0.27）差异有统计学意义（t=-3.39, P<0.05）。（4）BCG免疫60周组,豚鼠的肝脾肺综合病变指数为14.4±4.8,较对照组（56.9±5.0）差异有显著统计学意义（t=-6.16, P<0.01）;脾脏Mtb分离数的对数值(lg)为1.46±0.69,较对照组（5.43±0.20）差异有显著统计学意义（t=-5.55, P<0.01）。 结论 卡介苗保护力评价参考体系可靠稳定,我国临床应用卡介苗在该体系呈现优良保护效果。     

重组鼠疫组分疫苗毒理学研究

目的研究重组鼠疫组分疫苗的毒理学作用以评价其安全性,为进一步临床研究提供实验依据。 方法对重组鼠疫组分疫苗进行急性毒性试验,将疫苗1次给予小鼠后,观察所产生的毒性反应和死亡情况,及小鼠对该药物的最大耐受量。分别进行小鼠和豚鼠的异常毒性试验,观察动物有无异常反应,7d后每只动物体重变化。进行家兔的局部刺激试验,注射给药后对动物和注射部位进行肉眼观察,取注射局部皮肤组织进行病理检查。进行豚鼠的全身过敏试验,将致敏的动物静脉快速注射攻击,观察豚鼠有无过敏症状。 结果2种浓度疫苗经腹腔和皮下2种途径注射小鼠,均未引起小鼠的异常症状和死亡,小鼠对重组鼠疫组分疫苗的最大耐受量大于10000μg／kg。小鼠和豚鼠的异常毒性试验表明,注射后7d每组动物均全部健存、无异常反应,且7d后每只动物体重均有增加,均符合2005年版《中华人民共和国药典》三部要求。局部刺激试验中疫苗对家兔注射局部皮肤未引起明显的组织病理学改变。全身过敏试验未出现任何异常反应。 结论重组鼠疫组分疫苗的急性毒性试验、异常毒性试验、局部刺激试验和全身过敏试验毒理学实验结果显示,重组鼠疫组分疫苗用皮下注射的途径进行免疫是安全的。     

豚鼠过敏抗体的分离纯化及在PCA试验中作用规律的初步研究

目的 建立豚鼠Ⅰ型过敏反应模型,对致敏血清中过敏抗体(IgE、IgG)进行初步分离纯化,并探讨过敏抗体的作用特点.方法 以卵白蛋白(OVA)和Al(OH)_3作为免疫原制备豚鼠Ⅰ型过敏反应模型,ELISA法检测抗体含量,用饱和硫酸铵沉淀、Protein A柱亲和层析的方法 对致敏血清中IgE、IgG抗体进行初步分离纯化,以豚鼠连续被动皮肤过敏试验分别观察两种抗体在致敏后不同时间激发时引起皮肤蓝斑的变化情况.结果 模型组和对照组血清中IgE抗体含量分别为719.3750ng/ml、2.5250 ng/ml,IgG抗体吸光度(A)值分别为0.9921、0.0174,模型组两种抗体含量均比对照组显著升高(P<0.05).豚鼠9 d连续被动皮肤过敏试验中,IgE抗体在5 d PCA时产生的蓝斑直径达到最大,之后持续存在;IgG抗体在2 d PCA时产生蓝斑直径最大,之后迅速下降.结论 成功将致敏血清中两种过敏抗体进行了初步分离纯化,IgE和IgG抗体均参与了豚鼠Ⅰ型过敏反应,IgG抗体较IgE抗体可能作用更为迅速、短暂,有可能成为疫苗Ⅰ型过敏反应毒理学评价的另一主要指标.     

耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠巨噬细胞产生一氧化氮的影响

目的 探讨耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响.方法 将Balh/c小鼠随机分成生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组,分别注射生理盐水和不同剂量的耻垢分枝杆菌疫苗.取小鼠腹腔巨噬细胞体外培养,化学显色法测定培养上清中一氧化氮的含量.结果 生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组产生的一氧化氮分别为(3.50±3.11)、(16.63±6.47)、(13.97±6.20)和(7.55±2.26)ng/ml,不同剂量疫苗免疫小鼠产生的一氧化氮水平均显著高于对照组(P<0.01).结论 耻垢分枝杆菌疫苗可促进小鼠巨噬细胞产生一氧化氮.