人髓核间充质干细胞的分离提纯方式及生物学活性鉴定

目的 :探索人髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs)的提纯方法并鉴定其生物学活性。方法:收集3例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织(Pfirrmann分级均为Ⅳ级),利用酶消化法分离细胞。采用两种方法分离提纯NPMSCs,一组细胞采用贴壁法培养(贴壁组),另一组通过流式细胞分选技术利用NPMSCs表面阳性标志物CD73、CD90、CD105获得NPMSCs(流式组)。将两种方法获得的NPMSCs进行体外培养扩增,分别进行形态学观察,细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit,CCK-8)检测增殖能力。贴壁组NPMSCs采用流式细胞分选仪在进行分选之前检测免疫表型,流式组NPMSCs在生长达80%~90%融合时进行免疫表型的检测。向成骨、成脂、成软骨诱导分化,诱导28d后分别进行茜素红染色观察其成骨能力、油红O染色观察其成脂能力、甲苯胺蓝染色观察其成软骨能力,利用Imag J软件计算染色区域所占的面积百分比。比较两组NPMSCs在形态学、免疫表型及增殖和分化能力的差异。结果:形态学观察发现,两组NPMSCs均呈漩涡状生长,贴壁组NPMSCs可见散在的单个细胞生长;流式组NPMSCs长梭形形态更长,排列更加紧密,少见散在的单个贴壁生长细胞。流式细胞分选后所得的NPMSCs占细胞总数的(89.67±2.52)%,可以进行体外培养扩增,细胞为典型的长梭形特征,漩涡状生长,在接种后12~15d达80%~90%融合,增殖能力在接种后5~13d明显高于贴壁组NPMSCs(P0.05)。流式组NPMSCs的CD73、CD90、CD105的表达率明显高于贴壁组NPMSCs(P0.05),并且低表达CD34、CD45及HLA-DR。两种方法获得的NPMSCs均能完成三系诱导分化,流式组成骨、成脂、成软骨染色区域百分比均明显高于贴壁组(P0.05)。结论:利用流式细胞分选技术从人退变髓核组织中可获得较高纯度的NPMSCs,并能进行后续培养扩增。与贴壁法获得的NPMSCs相比,流式细胞分选的NPMSCs具有更强的增殖与分化能力。     

我国脊柱外科被引最高的50篇文献

目的筛选我国脊柱外科被引最高的50篇文献,分析其主要特征。方法利用中国生物医学期刊引文数据库,检索我国33本骨科主要期刊。根据被引频次排名,筛选脊柱外科被引最高的50篇文献,分析其主要信息。结果被引最高的50篇文献被引频次从391次到80次。发表于1994-2006年间。刊登于7本期刊,《中华骨科杂志》、《中国脊柱脊髓杂志》、《中华外科杂志》和《颈腰痛杂志》最多。分布于12个省市,北京最多。来源于24所机构,苏州大学一附院最多。8位第一作者发表一篇以上文献。脊柱退行性疾病相关文献最多。结论被引最高文献的总结有助于认识我国脊柱外科领域经典文献的主要特征,了解该领域发展历史并指导未来研究,为青年医师阅读提供参考。     

犬同种异体腰椎间盘移植的手术技术

[目的]研究并描述一种在无内固定辅助条件下建立犬同种异体椎间盘移植模型的手术技术。[方法]选取1岁龄健康杂种犬25只,处死其中的5只,在无菌条件下取L1~6椎间盘共25个液氮保存,剩余20只犬用于建立L5、6椎间盘移植模型的研究。术中,术后1、4、6、8、12周进行X线检查,观察移植椎间盘的位置、高度变化以及相邻椎体的愈合情况。[结果]椎间盘移植术前选取合适大小的供体椎间盘,术中注意保留前、后纵韧带及对侧纤维环,可以实现在无内固定条件下成功建立同种异体椎间盘移植模型。本研究椎间盘移植成功17例,其余2例出现椎间盘脱出,1例出现椎间盘感染。术后3个月影像学检查示移植椎间盘的上下终板与相邻椎体形成骨性愈合。与术前相比,术后3个月随访椎间盘高度无明显变化(P>0.05)。[结论]采用恰当的手术技术,有助于在无内固定辅助下成功实施同种异体椎间盘移植手术。本研究提供了一种建立犬同种异体椎间盘移植模型的可行的手术方案。     

来源于长管状骨的组织工程纤维环支架的理化特性及细胞生物学相容性研究

[目的]以来源于长管状骨的骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)为材料制备纤维环支架,并检测其理化特性及细胞生物相容性.[方法]以猪股骨近端松质骨为材料,制备外径为1 cm、内径为0.5 cm的中空环,经脱钙脱细胞处理后制成纤维环支架.支架行Hoechst 33258、HE、Ⅰ型胶原免疫荧光、天狼星红染色,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察并计算孔径,同时进行生物力学测定.四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)检测支架不同浓度浸提液的细胞毒性,取P1代山羊纤维环细胞,用注射器将细胞接种至支架上,体外培养48 h,通过活/死细胞染色(LIVE/DEAD cells staining)、扫描电镜(SEM)、HE染色评价支架与细胞的生物相容性.[结果]大体观察支架表面光滑,呈乳白色,扫描电镜支架孔隙分布较均匀且相连通,支架孔径为(401.4±13.1) μm,Hoechst 33258、HE染色均未见细胞残留,Ⅰ型胶原免疫荧光阳性,天狼星红染色支架红染,支架压缩弹性模量为(47.75±6.32) kPa.四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组间细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05),活/死细胞染色示细胞在支架上呈绿色荧光,扫描电镜和HE染色示细胞粘附在支架孔隙表面及周围,有基质分泌.[结论]以来源于长管状骨的骨基质明胶为材料制备的中空环形支架脱细胞彻底,具有合适的孔径结构,在机械性能、组成方面与正常纤维环相接近,具有良好的生物相容性,符合组织工程纤维环支架载体的条件.     

髋关节镜的治疗进展

髋关节是人体重要的负重关节,周围有坚强的肌肉保护以及丰富的神经结构,这使得对其病变的诊断及治疗相对困难。常规手术往往会严重损害周围软组织及重要结构,术后出现关节粘连等并发症的可能性较大。随着关节镜器械及技术的发展,髋关节镜的应用近20年得到了迅速发展,其具有切口小,对周围组织神经损伤轻等优点。关节镜对髋关节病变的诊断起到了重要作用,同时还提供了更好的治疗方式。随着设备与技术的改进,MRI在髋关节疾病诊断的广泛应用,关节镜微创治疗逐渐成为髋关节疾病的临床技术之一。     

TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导兔脂肪基质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

[目的]分离培养兔脂肪基质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),观察在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导下其生物学特性及向软骨细胞定向分化的能力.[方法]取4个月龄新西兰大白兔颈背部脂肪组织,分离、培养ADSCs.选取第3代,分为两组,实验组用软骨诱导液(含TGF-β1、bFGF、IGF)对细胞进行培养,对照组用普通高糖培养液培养,倒置显微镜观察两组细胞形态,MTT测定其增殖情况;14 d后行组织学观察(包括甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化),并实时荧光定量PCR检测两组细胞Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9基因的表达情况.[结果]实验组细胞逐渐变为软骨样细胞形态,增殖速度明显加快,14 d后实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化阳性,对照组为阴性,荧光定量PCR结果显示实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9的基因转录水平明显高于对照组.[结论]在TGF-β1,bFGF,IGF联合诱导条件下ADSCs增殖迅速,可高表达Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX 9,向软骨细胞定向分化.     

软骨脱细胞细胞外基质多孔支架与山羊髓核细胞生物相容性研究

目的 制备软骨脱细胞细胞外基质多孔支架,并探讨其与山羊髓核细胞的生物相容性.方法 猪关节软骨经研磨、脱细胞、冷冻干燥技术等处理制成三维多孔支架;从山羊腰椎间盘中分离出髓核细胞,培养后获取P1代细胞;四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测支架浸提液毒性;将髓核细胞以5×106/ml的密度接种在支架上体外培养48 h,通过倒置显微镜、HE染色、死活细胞染色(LIVE/DEAD染色)、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附及活性.结果 软骨脱细胞基质多孔支架在敷水状态下光滑透明,分离的髓核细胞呈典型的软骨细胞样形态;MTT检测各组间增殖,其差异不具有统计学意义(P＞0.05);倒置显微镜、电镜观察髓核细胞呈球状或短梭形均匀地贴附在支架内部,HE染色观察可见髓核细胞均匀分布在支架内部,LIVE/DEAD染色显示全部为绿色荧光(活细胞),未见红色荧光(死细胞).结论 软骨脱细胞基质多孔支架在组成上与髓核组织相似,与山羊髓核细胞具有良好的生物相容性,可以作为髓核组织工程的支架材料.     

以骨基质明胶及软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架的实验研究

 目的 以骨基质明胶和软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架,并检测其理化性能及细胞相容性。方法 制备中空骨基质明胶环,并注入脱细胞软骨匀浆,经冷冻干燥、交联后制备成一体化纤维环-髓核双相支架。行Hoechst 33258、天狼星红、HE染色,扫描电镜观察支架内部结构,检测支架孔隙率和吸水率,检测双相支架复水后的力学性能。分离山羊纤维环和髓核细胞,接种至双相支架的相应部位,体外培养48 h,扫描电镜、活/死细胞染色评价支架与细胞的生物相容性。结果 镜下Hoechst 33258染色未见细胞残留,天狼星红染色阳性,HE染色示两部分结合紧密。扫描电镜可见支架呈多孔结构,孔隙相连通,纤维环相孔径为(401.4±13.1) μm,髓核相孔径为(112.4±21.8)μm。支架孔隙率为73.37%±2.56%,支架吸水率为655.7%±78.6%。支架压缩弹性模量为(49.06±15.57)kPa,小于正常椎间盘的(135.9±28.9)kPa,但在同一数量级。扫描电镜观察细胞黏附于支架表面,细胞周围有基质分泌,live/dead细胞染色示细胞在支架上活性良好。结论 以天然骨基质明胶和软骨基质构建的一体化纤维环-髓核双相支架,无免疫原性,具有良好的孔径和孔隙率,支架两部分连接处结合紧密,在结构、生化成分及生物力学性能上与椎间盘组织相似,且具有良好的生物相容性。     

PKH26荧光标记牛尾髓核细胞的实验研究

【摘要】 目的 探讨PKH26荧光标记在牛尾髓核细胞的应用研究。方法 从牛尾椎间盘中分离髓核组织,通过酶消化法获取原代细胞,倒置显微镜下观察,P1代髓核细胞进行番红O、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色,对P1代髓核细胞进行PKH26荧光染料标记,并对标记后细胞的活性、荧光强度（0、14、28d）及增殖特性进行评估。结果 分离得到的髓核细胞数为1.56±0.35×106/g,倒置显微镜下,原代细胞4d开始贴壁,细胞成群生长,13d铺满瓶底,原代细胞、 P1代细胞均呈类软骨样细胞形态;P1代髓核细胞甲苯胺蓝染色异染、番红O染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性;PKH26标记前后细胞活性均在95%以上,0d、14d、28d呈递减趋势,但28d时细胞仍可以检测出较强的荧光,标记后的细胞生长曲线与标记前的细胞生长曲线差异无统计学意义（P＞0.05)。结论 牛尾髓核组织中可以分离出数量满意的髓核细胞,而且具有软骨样细胞的表型,可以用作种子细胞;PKH26标记后的髓核细胞无生物学特性的变化,可以用作髓核细胞体内研究的示踪染料。