纳米粒子载体携带反义转化生长因子-β1基因的局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响

目的探讨纳米粒子携带反义转化生长因子(TGF-)β1局部定位转染对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响。方法45只大鼠制成自体静脉移植模型后,分成纳米粒子DNA组、纳米粒子空载体组和生理盐水对照组,进行局部定位转染,2周后观察移植静脉内膜的变化,应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)、Westernblot以及免疫组织化学等方法检测反义基因对内源性TG-Fβ1表达的影响。结果基因转染后两周,内膜厚度为(20.5±4.7)μm,明显小于两个对照组(P<0.01)。RTPCR和Westernblot结果表明,基因转染组的TGF-β1mRNA和蛋白的表达明显低于空载体组及生理盐水对照组。结论纳米粒子可有效地作为基因的转移载体;纳米粒子携带反义TGF-β1可以减少内源性TGF-β1基因的表达,抑制细胞外基质(ECM)的合成,从而达到抑制内膜增生的目的。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

HSP70-肿瘤肽复合物的纯化及其对肝癌细胞株HepG-2增殖的作用

目的:应用快速蛋白液相色谱(FPLC)系统从肝癌组织中分离和纯4EHSP70-肽复合物,并研究其对肝癌细胞系HepG-2增殖的影响．方法:将组织进行匀浆、高速离心提取总蛋白后依次进行ConA-Sepharose亲和层析和 DEAE-Sephacel子交换层析分离纯化,所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行蛋白分子质量及性质鉴定,Bradford 法测定蛋白浓度;利用MTT方法检测HSP70- 肽复合物对HepG-2细胞增长的情况．结果:分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯量蓝鉴定为单一带, 分子质量为70 kDa;Western blot结果证实为 HSP70,每10 g组织最终获得1．5 mg的HSP70; HSP70刺激组12,48,72 h与对照组的A值之间有显著差异(0．1 mg／L:t=-0．2500,P=0．00; t=-0．1777,P=0．001:t=-0．3094,P=0．001; 0．5 mg／L:t=-0．2878,P=0．00;t=-0．2044,P= 0．00;t=-0．3285,P=0．00;1 mg／L:t=-0．3118, P=0．00;t=-0．2592,P=0．00;t=-0．1994, P=0．025;5 mg／L:t=-0．4007,P=0．00;t= -0．1302,P=0．016;t=-0．2537,P=0．005),细胞存活率明显高于对照组(P<0．01)．结论:使用本分离纯化方法可获得高纯度 HSP70肽复合物;HSP70肽复合物可以促进 HepG-2细胞的生长．     

PI3K/AKT信号转导系统在土槿皮乙酸诱导胃癌细胞凋亡中的作用

以不同浓度的土槿皮乙酸(PAB)分别处理BGC823细胞24 h,采用MTT法检测PAB对细胞增殖抑制作用,PI染色检测细胞凋亡率及细胞周期,Western blot法检测PAB对Caspase-3剪切片断及PI3K与Akt通路相关蛋白表达的影响.结果 发现,PAB对BGC823细胞的增殖具有显著的抑制作用,呈剂量及时间依赖性.Caspase-3蛋白出现断裂片断,并随着浓度的增加断裂更明显,磷酸化PI3K/AKT开始降低,72 h降低最明显,而非磷酸化的PI3K/AKT无明显改变.认为PAB具有明显的细胞毒作用,通过PI3K/AKT途径激活Caspase-3诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖.     

从石蜡包埋肺癌组织提取RNA检测PML基因转录的研究

背景与目的 甲醛同定石蜡包埋组织(FPE)包含大量临床病理信息,同时还含有大量的基因和蛋白物质可用来研究临床意义.本研究的目的是探讨从FPE中提取RNA的可能性,检测急性早幼粒细胞白血病基因(PML)在肺癌FPE中的转录表达.方法选取前期经免疫组织化学染色证实无PML蛋白表达的40例肺癌FPE,存档时间在60-85个月,5例新鲜冰冻肺腺癌组织作为对照;利用Trizol一步法提取RNA,经OD值检测验证RNA质量;RT-PCR检测PML的基因转录表达.结果 自肺癌FPE和新鲜冰冻组织提取的RNA的OD比值在1.7-2.1.RT-PCR显示,40例FPE以及5例新鲜冰冻组织中,PML(295 bp)以及β-actin(318 bp)mRNA均有表达.结论 利用Trizol一步法自FPE提取RNA进行RT-PCR,可有效扩增出300bp左右的产物;肺癌组织中PML蛋白存在转录后缺失.     

铝暴露对大鼠认知能力及海马Ng蛋白表达影响

目的研究慢性铝暴露对大鼠海马神经颗粒素（Neurogranin,Ng）蛋白表达的影响,探讨慢性铝暴露损害大鼠认知能力的机制。方法选择断乳后Wistar大鼠,以含有不同浓度AlCl3水溶液进行饲养。3个月后,进行跳台行为测定,蛋白免疫印迹法检测Ng蛋白表达。结果染铝组大鼠的血铝分别为（6.0±0.9）,（6.1±1.2）,（17.7±1.4）μg/L,与对照组（4.1±1.3）μg/L比较均升高,差异有统计学意义（P〈0.01）;染铝组潜伏期分别为（166.00±21.33）,（120.23±15.44）,（79.86±10.35）S,与对照组（300S）比较均缩短（P〈0.01）;染铝组与对照组Ng的蛋白表达降低（P〈0.05）。结论不同浓度慢性铝暴露可以引起大鼠脑铝和血铝的含量增高,使海马Ng的蛋白表达下降,导致大鼠认知能力降低。     

铝暴露对大鼠海马CA1区长时程增强及α-CaMK Ⅱ活性的影响

目的:探讨慢性铝暴露对海马CA1区长时程增强(LTP)及钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(α-CaMKⅡ)活性的影响。方法:选择断乳后Wistar大鼠,分别以含有0.2%、0.4%、0.6%(W/V)的氯化铝(AlCl3)蒸馏水饲养。3个月后,测定脑铝、血铝的含量;用电极刺激海马的CA1区,记录单脉冲刺激引起的峰电位(PS),观察高频刺激前后各组的变化;用Westernblot方法,检测α-CaMKⅡ活性。结果:高频刺激后,铝暴露组PS幅值明显低于对照组(P<0.01);铝暴露组α-CaMKⅡ的活性和对照组相比明显降低(P<0.01)。结论:慢性铝暴露抑制大鼠CA1区LTP的形成,这种抑制可能与其抑制α-CaMKⅡ的活性有关。     

慢性铝暴露对大鼠海马神经元中toll样受体4蛋白及其mRNA表达的影响

目的 通过研究铝暴露对介导天然免疫的关键蛋白toll样受体(TLR)的影响,探讨慢性铝暴露诱导学习记忆损伤的潜在机制.方法 取80只断乳后Wistar大鼠,随机分为4组,每组20只;其中1组为对照组(用蒸馏水喂养),其他3组为铝暴露组,分别用含0.2%、0.4%和0.6%浓度的AlCl_3蒸馏水喂养3个月.免疫印迹(Western blot)方法检测各组大鼠海马中TLR4的蛋白表达情况;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠海马中TLR4 mRNA的表达情况.结果 铝暴露组大鼠的学习记忆能力下降;与对照组(0.91±0.14)相比,0.2%、0.4%和0.6%浓度的铝暴露各组海马组织TLR4的蛋白表达(0.95±0.15、1.44±0.22、2.03±0.28)显著增高(F=37.575,P<0.05);与对照组(0.59±0.06)相比,铝暴露各组TLR4 mRNA的表达(0.86±0.04、0.95±0.04、1.06±0.09)显著增高(F=65.474,P<0.05).结论 慢性铝暴露损伤大鼠的学习记忆能力可能与上调TLR4蛋白及其mRNA的表达相关.     

牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K-caspase样亚基的表达与青春期龈炎的临床相关性

目的检测并比较青春期龈炎的牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，PS）临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K（gingipain K，Kgp）-caspase样亚基的表达强度及酶活性，揭示Kgp与青春期龈炎之间可能存在的致病关系。方法检测并记录36例14～17岁的青春期龈炎患者的牙龈指数、龈沟出血指数及探诊深度，取龈下菌斑进行Pg的分离培养，16SrRNA PCR法鉴定。将获得的10个Pg临床分离株复苏，在对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白，测定其酶活性，并用Kgp-caspaae样亚基的单克隆抗体进行Western blot检测。Kgp的表达强度及酶活性与各牙周指数之间的相关关系用等级相关系数。结果青春期龈炎的Pg临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中，Kgp-caspase样亚基的表达强度及酶活性与各牙周指数的大小呈正相关关系，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论青春期龈炎龈下菌斑中Pg的Kgp十分复杂，存在表现为低相对分子质量形式的caapase样活性分子，这些细胞内功能蛋白分子将影响Pg和宿主间的相互作用；Kgp对青春期龈炎有一定的致病作用。