Ⅰ型疫苗衍生脊髓灰质炎病毒循环的发现和基因特点

目的分析贵州省2004年Ⅰ型循环的疫苗衍生脊髓灰质炎(脊灰)病毒(cVDPVs)的基因特征,阐述cVDPVs的出现为全球消灭脊灰带来的挑战。方法2004年中国疾病预防控制中心(CDC)病毒病预防控制所国家脊灰实验室对各个省送检的每1个脊灰病毒分离株进行聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和酶联免疫吸附试验(ELISA)两种方法的型内鉴定。毒株型内鉴别显示异常时,则对该株病毒进行VP1编码区全基因的序列测定和分析。结果2004年从贵州省CDC送检的脊灰病毒株(或粪便标本的复核)中,共发现9株Ⅰ型疫苗衍生脊灰病毒(VDPVs)。这9株VDPVs从2例急性弛缓性麻痹(AFP)病例和4名接触者的粪便标本中分离到。其中8株分离于贞丰县挽兰乡的2例AFP病例和3名接触者,另外1株分离于贞丰县白层镇的1名AFP病例接触者。结论对9株cVDPVs的VP1编码区的序列测定和分析证实,它们有相似的核苷酸序列,共享5个核苷酸突变位点,说明VDPVs已发生了循环。cVDPVs很可能来源于2003年秋季的1次口服脊灰减毒活疫苗病毒的传播。对其中5株VDPVs的3D区和1株VDPV(8229-2)的全序列测定和分析,未发现脊灰病毒血清型之间的重组,也未发现与非脊灰肠道病毒的重组。     

贵州省2004年分离到的脊髓灰质炎病毒分子生物学特征

目的研究贵州省2004年分离到的脊髓灰质炎(脊灰)病毒分子生物学特征。方法对贵州省2004年分离到的所有脊灰病毒,用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行了型内鉴定,并对型内鉴定异常株进行了VP1区的序列测定。结果贵州省在2004年急性弛缓性麻痹(AFP)病例及接触者、流动人口和健康儿童的粪便标本中,共有95例分离到脊灰病毒。其中Ⅰ型22例,Ⅱ型26例,Ⅲ型21例,混合型19例,脊灰病毒混合非脊灰肠道病毒7例。经用PCR-RFLP和ELISA方法进行型内鉴定,共有16株病毒与疫苗株病毒存在差异,其中3株脊灰病毒与疫苗株病毒在PCR-RFLP图谱上有差异[其中1株同时为双反应(DRV)],3株ELISA结果为DRV,11株ELISA结果为非疫苗类似株(NSL)。在这些型内鉴定异常株病毒中,Ⅰ型13株,Ⅱ型3株。对这16株脊灰病毒进行VP1区序列测定,发现9株Ⅰ型疫苗衍生脊灰病毒(VDPV)和1株Ⅱ型VDPV。结论根据对贵州省2004年从95例AFP病例及接触者、流动人口、健康儿童分离的脊灰病毒的血清定型结果和型内鉴定结果及对13株Ⅰ型和8株Ⅱ型脊灰病毒VP1区核苷酸序列测定证实,脊灰减毒活疫苗病毒在人群的循环导致疫苗病毒神经毒力恢复突变。通过AFP病例监测系统及时发现了Ⅰ型VDPV的循环和Ⅱ型VDPV。对2004年下半年脊灰病毒基因特点的分析,提示贵州省已经阻断了Ⅰ型VDPV的循环。     

中国2012年脊髓灰质炎实验室网络的运转与评价

目的通过对中国2012年脊髓灰质炎（脊灰）实验室网络（Polio Laboratory Network,PLN）监测数据（未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区,下同）进行统计分析,评估其运转情况,为中国重新恢复无脊灰状态提供实验室依据。方法分析中国免疫规划监测信息管理系统数据库中,31个省（自治区、直辖市,下同）报告的急性弛缓性麻痹（Acute Flaccid Paralysis,AFP）病例个案调查表和中国疾病预防控制中心（Center for Disease Control and Prevention,CDC）病毒病预防控制所国家脊灰实验室（National Polio Laboratory,NPL）的监测数据库,总结PLN运转中的质量控制,评价PLN的各项运转指标。结果中国2012年PLN共收集了6163例AFP病例的12204份粪便标本,14d内双份粪便标本采集率为92．6％,合格粪便标本采集率为92．1％。按世界卫生组织（World Health Organization,WHO）第4版《脊灰实验室手册》的要求进行病毒分离和鉴定,试验结果28d内及时反馈率为99％。2012年,在116例AFP病例粪便标本中分离到脊灰病毒（Poliovirus,PV）,分离率为2．10％（116／5534）;在680例AFP病例粪便标本中分离到非脊灰肠道病毒（Non—polio Enterovirus,NPEV）,分离率为12．29％（680／5534）。2012年,NPL收到PLN送检的283株PV,对375株单血清型PV采用衣壳蛋白（Capsid Protein）VP1编码区核苷酸序列测定与分析进行型内鉴定（Intratypic Differentiation,ITD）,发现7例（共计25株）疫苗衍生（Vaccine—derived）PV（VDPV）,其中Ⅰ型2株,Ⅱ型16株,Ⅲ型7株,未发现野生型（Wild Type）PV（WPV）。2012年,NPL收到环境监测送检的314株PV,全部采用VP1编码区核苷酸序列测定与分析进行ITD,在山东省发现1株VDPV。2012年8月,NPL作为WHO西太平洋区脊灰参比实验室接受并以优异的成绩通过了WHO的年度现场认证;2012年10月,NPL以满分的成绩通过了荧光定量聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）和VDPV筛查的职能考核;2012年12月,又以满分通过了WHO核苷酸序列测定和分析的第一次职能考核。在中国PLN中,有11个省级CDC脊灰实验室参加并通过了WHO的实验室现场评估认证;22个省级CDC脊灰实验室参加并以满分的成绩通过了荧光定量PCR和VDPV筛查的职能考核。2012年10月9日,WHO通过对中国AFP病例监测质量和结果的评估,宣布中国重新恢复无脊灰状态。结论2012年,PLN运转正常、敏感有效,在AFP病例和环境监测中未发现WPV,为中国恢复无脊灰状态提供了关键的技术支撑作用。     

酶联免疫吸附试验筛查疫苗衍生脊髓灰质炎病毒的效果评价

目的评价和分析酶联免疫吸附试验(ELISA)在脊髓灰质炎(脊灰)病毒型内鉴别(Intratypic differentiation,ITD)中的应用,及其在疫苗衍生脊灰病毒(Vaccine-derived polioviruses,VDPVs)筛查中的敏感性和重要性。方法使用ELISA型内鉴定方法对2004年所有省级疾病预防控制中心脊灰实验室送检的单型脊灰病毒进行型内鉴定,然后对结果为非疫苗类似株(Non Sabin-like,NSL)或者双反应毒株(Double reactive virus,DRV)进行VP1区基因序列测定和分析。结果2004年606株单型脊灰病毒中,有576株被鉴定为疫苗类似株(Sabin-like,SL),11株为NSL,全部是Ⅰ型;17株为DRV,2株为无反应株(Non-reactive virus,NRV)。通过对ELISA结果为NSL、DRV或NRV的毒株进行全VP1区核苷酸序列测定和分析,检测出9株Ⅰ型VDPVs和1株Ⅱ型VDPV。结论ELISA进行型内鉴定的优势在于它最敏感的筛选指标是VP1区核苷酸变异率为1%,即它可以有效地区分脊灰疫苗病毒相关株和其它毒株,包括VDPV(核苷酸变异率≥1%,但<15%)和脊灰野病毒(核苷酸变异率≥15%),因此对VDPV的筛查具有较强的优势。     

中国脊髓灰质炎疫苗株病毒VP1区基因突变热点分析

目的研究中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区)急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测系统中分离到的脊髓灰质炎(脊灰)疫苗株病毒VP1区基因核苷酸突变热点及其分子生物学特征。方法对从中国1996~2002年AFP病例中分离的693株单血清型脊灰病毒进行VP1区核苷酸序列测定和分析,并对序列结果进行比对分析和统计学分析。结果VP1区核苷酸序列测定和分析结果,未检出脊灰野病毒,全部为脊灰疫苗株病毒。在所有疫苗株病毒中,发现了一些VP1区基因核苷酸突变热点,例如Ⅰ型病毒的nt2 747位点和nt2 795位点、Ⅱ型病毒的nt2 909位点、Ⅲ型病毒的nt2 636位点,突变发生率分别为34.8%、47.3%、84.8%、53.3%。4个突变热点共有8种核苷酸变异形式,其中3种核苷酸变异形式为转换(Ⅰ型A2795G、Ⅱ型U2909C、Ⅲ型G2636A),另外5种为颠换(Ⅰ型A2747U、A2747C、A2795U和Ⅱ型U2909A、U2909G)。4个突变热点全部导致了编码氨基酸的突变。在编码氨基酸的突变中,除Ⅰ型A2747U、A2 747C、A2 795U导致相似性质的氨基酸之间发生替代外,其余都发生了极性氨基酸和疏水性氨基酸的替换。某些导致不同性质编码氨基酸替换的突变热点同时也是已知的神经毒力决定位点。结论因为有突变热点的存在,说明在VP1区基因中突变的核苷酸并不是完全随机分布的;由于脊灰病毒的VP1区基因突变热点可能与它的生物学特性(如神经毒力)有一定的关联性,因此对VP1区基因突变热点的检测,可作为中国脊灰病毒学监测中的一个重要方法。     

中国2006年脊髓灰质炎实验室网络的运转与监测

目的通过对中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区,下同)2006年脊髓灰质炎(脊灰)实验室网络监测结果进行分析,评估其运转情况,提供中国继续维持无脊灰状态的实验室依据。方法分析31个省(自治区、直辖市,下同)急性弛缓性麻痹(AFP)病例个案调查表数据库和中国疾病预防控制中心(CDC)病毒病预防控制所国家脊灰实验室监测数据库,总结脊灰实验室网络运转中的培训和质量控制,评价实验室网络运转的各项指标。结果2006年全国脊灰实验室网络收集了5 299例AFP病例的10 537份粪便标本,按《世界卫生组织(WHO)脊灰实验室手册》的要求进行病毒分离和鉴定。28d内完成病毒血清型定型的及时率为88.7%,AFP病例中分离到脊灰病毒(PV)的280例,分离率为5.3%;分离到非脊灰肠道病毒的551例,分离率为10.4%。国家脊灰实验室对2006年全国脊灰实验室网络分离到的359株PV进行了聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)型内鉴定,对462份单血清型PV进行了酶联免疫吸附试验(ELISA)型内鉴定。并对PCR-RFLP及ELISA型内鉴定有异常的毒株或分离于零剂次服苗的AFP病例的毒株及部分Ⅲ型毒株,共180株进行VP1基因核苷酸序列测定和分析,未发现脊灰野病毒。但在广西壮族自治区的1例AFP病例和7名接触者中,分离到8株Ⅰ型疫苗衍生脊灰病毒(VDPVs),在上海市1名健康儿童中分离到1株Ⅲ型VDPV。在培训和质量控制方面,2006年举办了两期全国脊灰实验室新人手把手培训班,12个省CDC脊灰实验室16人参加了培训。2006年,国家脊灰实验室以优异的成绩通过WHO的2006年度能力验证和现场认证;31个省CDC脊灰实验室通过了2006年度盲样标本能力验证;内蒙古、江苏、福建、云南、湖南、四川、新疆、安徽8个省CDC脊灰实验室通过了WHO的实验室现场认证。结论中国2006年脊灰实验室网络运转良好,已建立的科学化、系统化、规范化的质量控制体系取得良好的实效和发挥了应有的作用。中国2006年继续保持无脊灰状态,脊灰实验室网络运转正常,监测系统敏感,为维持无脊灰提供了实验室依据。     

利巴韦林注射液在细胞水平上抑制EV71病毒复制的初步研究

目的 通过体外实验,观察利巴韦林注射液对肠道病毒71型(EV71)病毒在横纹肌肉瘤传代细胞(RD-A细胞)复制的抑制作用和体外灭活作用.方法 使用在2008年4月安徽阜阳疫情中分离到的EV71病毒,通过三种体外细胞实验:药物在细胞中抑制EV71病毒复制的药效测定实验;药物对细胞的保护作用实验;药物体外对EV71病毒的灭活作用的药效测定实验.观察利巴韦林注射液对EV71病毒感染横纹肌肉瘤传代细胞(RD-A细胞)中所起的作用.结果 在利巴韦林注射液在细胞中抑制EV71病毒复制的药效测定实验中,1:640利巴韦林注射液稀释度组较病毒对照组延迟病变出现2 d,细胞生长未受到影响.在药物对细胞的保护作用实验中,1:8利巴韦林稀释度组较病毒对照组延迟病变出现4 d.在利巴韦林注射液药物体外对EV71病毒的灭活作用的药效测定研究中,1:40稀释度组较病毒对照组延迟病变出现2 d,而细胞生长未受到影响.结论 利巴韦林注射液在体外有抑制EV71病毒复制和部分灭活病毒的作用;并有一定的保护细胞抑制EV71病毒感染的作用.本研究对于临床上EV71感染的早期预防和治疗具有一定的指导意义.     

中国2005年脊髓灰质炎实验室网络的运转与监测

目的利用中国(未包括香港、澳门特别行政区和台湾地区)2005年维持无脊髓灰质炎(脊灰)状态的实验室资料,评估脊灰实验室网络的运转与监测情况。方法分析31个省(自治区、直辖市,下同)急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测系统经计算机联网上报的AFP病例个案调查表数据库和中国疾病预防控制中心(CDC)病毒病预防控制所国家脊灰实验室监测数据库。结果2005年31个省CDC从5 195例AFP病例中收集了10 340份粪便标本,所有粪便标本在L20B、RD细胞上同时进行病毒分离。从293例AFP病例粪便标本中分离到脊灰病毒(PV),分离率为5.64%;从551例AFP病例粪便标本中分离到非脊灰肠道病毒(NPEV),分离率为10.61%。国家脊灰实验室共收到各省CDC脊灰实验室送检的404株PV标本;其中293株分离于AFP病例,其余分离于AFP病例接触者、流动人口和健康人群。对404株PV使用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析(PCR-RFLP)进行型内鉴定,PVⅠ型疫苗株72株,PVⅡ型疫苗株138株,PVⅢ型疫苗株74株,混合型疫苗株91株,PV NPEV 12株,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型疫苗变异株分别为6、6、5株。将PV混合株进行单型分离后,进行酶联免疫吸附试验(ELISA)型内鉴定,共鉴定单型毒株521株,其中疫苗类似株(SL)498株,占所有送检毒株的95.59%;非疫苗类似株(NSL)2株,占0.38%;双反应株(DRV)18株,占3.45%;阴性2株;无效1株。所有型内鉴定异常和部分从高危零剂次服苗者分离的118株,做了VP1编码区全基因的序列测定和分析。在江苏、安徽省CDC陆续送检的编号为9230病例的33份病毒分离物(其中江苏省2份,安徽省31份),连续8个月从安徽省舒城县1例免疫缺陷患儿分离到疫苗衍生脊灰病毒(iVDPV);VP1编码区全基因的序列测定图谱显示,19株Ⅱ型iVDPVs,13株Ⅲ型iVDPVs。2005年世界卫生组织(WHO)使用5份盲样标本进行病毒分离职能考核,31个省CDC脊灰实验室成绩均为满分。对14个省CDC脊灰实验室进行了现场考核,全部通过认证。结论中国2005年继续维持无脊灰状态,脊灰实验室网络运转正常,为维持无脊灰提供了完整的实验室依据。     

麻疹野病毒的分离及血清学的初步分析

从１９９３年山东省和湖南省１０例麻疹急性期患者的咽拭子中，用Ｂ９５ａ细胞分离到７株麻疹野病毒，同时用 Ｖｅｒｏ细胞分离未获成功。将此 ７株病毒以 １０４ＴＣＩＤ５０／ｍｌ剂量分别接种到 Ａ－Ｖｅｒｏ细胞，只有１株出现融合病变，其它毒株未见增殖。抗麻疹血凝素（Ｈ蛋白）单克隆抗体（１２Ｅ）对分离株的中和滴度低于Ｌ４株６０倍以上。在同期收集的１３例麻疹患者血清，经ＥＬＩＳＡ法检测，３ 例ＩｇＧ抗体阴性，３例抗体滴度为１：２００～１：８００，但７例滴度在１：３２００～１：１０２　４００之间，占５４％．１３例血清中１２例ＩｇＭ抗体阳性。