p21WAF1与p27KIP1真核双表达载体的构建鉴定及在胃癌细胞中的表达

目的 构建p21WAF1与p27KIP1真核双表达载体,体外转染胃癌7901细胞,观察其在胃癌细胞中的表达及相关特性.方法 提取人全血总RNA,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增p21WAF1和p27WAF1基因并将其分别克隆到真核双表达载体pIRES中构建重组质粒pIPES-p27KIP1-p21WAF1,经酶切和测序鉴定重组质粒.脂质体介导重组质粒plRES-p27KIP1.p21WAF1"转染胃癌7901细胞,收集并提取转染后12、24、48、72 h和5 d各细胞的总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测各细胞中p21WAF1和p27KIP1在RNA水平的表达.带有绿色荧光蛋白的pIRES-EGFP作为对照.结果 RT-PCR扩增分别获得约500和600 bp大小的产物,重组质粒pIRES-p27KIP1.p21WAF1经酶切和测序鉴定证实为p21WAF1和p27KIP1基因.转染胃癌7901细胞48 h时转染率为68%.与空质粒对照组比较,重组质粒转染胃癌7901细胞12、24、48、72 h和5 d后FQ-PCR证实p27KIP1的Ct值(cycle threshold,Ct)分别减少8.2、10、10、7.4和6.7,p21WAF1的Ct值分别减少7.4、8.2、8.2、6.3和5.70其中24 h和48 h的Ct值减少最大.结论 真核双表达载体pIRES-p27KIP1.p21WAF1构建成功并能在胃癌7901细胞内高效表达.     

白细胞介素8－251A/T单核苷酸多态性及其血浆水平与冠心病易感性的关系

目的研究白细胞介素8-251A/T单核苷酸多态性及其血浆水平与冠心病易感性的关系。方法应用聚合酶链反应限制片长多态性检测冠心病组与对照组白细胞介素8-251A/T单核苷酸多态性,酶联免疫吸附法测定白细胞介素8血浆水平。结果白细胞介素8血浆水平在冠心病组显著高于对照组(P<0.05),-251A/T基因型频率、等位基因A和T频率在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。但是与其他冠心病患者相比,急性冠状动脉综合征患者AA基因型明显减少(OR=0.43,95%CI为0.2～0.97,P<0.05)。结论白细胞介素8血浆水平与冠状动脉粥样硬化病变有相关性。-251A/T位点单核苷酸多态性与冠心病无相关性,但可影响冠心病的临床表现。AA基因型或许能降低急性冠状动脉综合征的发病风险。     

中华按蚊幼虫肠壁膜泡的制备及其鼠抗血清对幼虫？…

搞清Ｂ．ｓ杀虫蛋白对纹幼虫肠细胞膜的作用机理，从而改进杀虫蛋白活性。方法差速离心制备肠细胞膜泡，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析其蛋白组分；测试其鼠抗血清对蚊幼虫的效应。     

肠道病毒中枢神经系统感染患儿脑脊液中VP1序列的分子分型研究

目的 探讨肠道病毒(EV)中枢神经系统感染患儿脑脊液(CSF)中VP1序列分子分型研究的临床价值.方法 2003年1月至2005年12月青岛大学附属医院和滨州医学院附属医院采用通用引物和VP1段分子分型引物分别对63例无菌性脑膜炎和脑炎惠儿急性期和恢复期的CSF标本进行扩增,对VP1分型引物扩增阳性片段进行克隆、测序及分型研究.结果 采用通用引物经2次PCR检测急性期患儿的CSF标本共47例(47/63,74.6%)阳性,恢复期仅3例(3/57,5.3%)阳性.采用分型引物经2次PCR检测通用引物扩增阳性的47例急性期的CSF标本共3l例(62.0%)阳性,其中4例脑炎和20例脑膜炎进行了序列测定.测序结果通过BLAST软件进行同源性对比分析,发现同-型别内序列同源性在97%～99%,不同型别之间同源性只有74%～76%,其中COX B3(9例)、ECHO 12(7例)、ECHO 30(3例)、COX A7(2例)、COX A9(1例)、COX B5(1例)、COX A11(1例).所有CSF进行病毒分离,11例(11/63,17.5%)阳性,阳性率明显低于VP1段分子分型的检测结果,除1例CSF标本病毒分离为ECHO7的患儿,通用引物扩增阳性而VP1分型引物扩增失败外,其余血清型别与VP1段分子分型研究结果完全-致.结论 EV是儿童无菌性脑膜炎和脑炎最重要的病原体;采用通用引物所建的RTPCR是快速检测EV中枢神经系统感染的有效方法;分型引物扩增VP1部分序列并测序,与GENBANK中的EV标准毒株进行对比,根据基因序列的同源性进行EV分型,为EV的分型研究提供了新的方法和思路.     

p21waf1基因转染对乳腺癌细胞中心体复制和增殖活性的影响

目的 观察p21waf1基因转染对人乳腺癌细胞增殖活性和中心体复制的影响.方法 应用脂质体介导法将pIRES-p21waf1真核表达载体转染人人乳腺癌细胞系MCF-7,MTF法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期分布,免疫荧光技术检测乳腺癌细胞的中心体复制情况.结果 p21waf1基因转染后乳腺癌细胞生长显著受抑制,细胞周期停滞于G1期,转染组G1期、S期和G2/M期细胞比例分别为(70.52±3.21)%、(16.38 4±1.17)%、(9.42 ±0.98)%,未转染组则为(49.84±1.58)%、(36.83±1.36)%、(15.64±1.09)%,两者比较差异有统计学意义,P值分别《0.01、《0.05、《0.05.中心体复制异常的乳腺癌细胞数较转染前明显减少(P《0.01).结论 p21waf1基因转染能够抑制人乳腺癌细胞增殖和中心体的异常复制,进而阻止乳腺癌的发生发展,可能成为乳腺癌治疗的一种新手段.     

ApoE基因多态性与血管性痴呆关系的实验研究

目的　探讨 Apo E基因多态性与血管性痴呆 ( Va D)的相互关系。方法　应用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 ( PCR-RFLP)技术 ,检测脑卒中后 Va D组与未发生 Va D的对照组患者的 Apo E基因型分布及出现频率。结果　 Apo E基因的ε4 / 4基因型 ,在 Va D组的出现频率明显高于未发生 Va D的对照组 ( P<0 .0 5 ) ,其余各基因型的出现频率 ,两组间差异无显著性 ( P>0 .0 5 )。结论　Apo E基因的 ε4 / 4基因型与 Va D的发生密切相关 ;等位基因ε4可能是 Va D的一种遗传易感性因子。     

3种基因工程藻对中华按蚊幼虫杀灭作用的实验研究

本实验观察了３种基因工程杀蚊幼蓝藻对中华按蚊Ⅲ龄幼虫的杀灭作用。结果表明，当喷施工程藻浓度高于３．０×１０５ｃｅｌｓ／ｍｌ时，作用２４ｈ后，中华按蚊幼虫死亡数较低，而在４８ｈ、７２ｈ后蚊幼虫大部分（６７％以上）死亡；在喷施工程藻浓度低于３．０×１０４ｃｅｌｓ／ｍｌ时，２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ的杀蚊幼效果均较差，此结果明显低于工程藻对淡色库蚊幼虫的作用效果。因此在应用基因工程藻进行现场控制蚊幼虫时，特别是在有较多按蚊幼虫的孳生地，应该考虑联合应用其它防治方法。     

不同温度下淡色库蚊增殖能力的实验研究

在六个不同温度（１６，１９，２２，２５，２８和３１℃）下观察了淡色库蚊种群的发育、存活和繁衍的动态，证明该蚊种的卵、幼虫及成蚊的发育历期和生殖营养周期在观察温度范围内均随温度的升高而缩短，在温度低于１６℃和高于３１℃时该蚊种卵的孵化率、幼虫的存活率及成蚊的产卵力极低，而且不易存活。在表示种群增殖的参数中，内禀增长能力（ｒｍ）和周限增长速率（λ）在１６～２８℃时随温度的升高而逐渐增强（ｒｍ由０．１３５４到０．１９９５，λ由１．１４５０到１．２２０８），而在３１℃时却呈降低的趋势（ｒｍ＝０．１８７７，λ＝１．２０６５）。其中２５～２８℃时的增殖能力最强。经统计显示，潜在性传播丝虫病的蚊虫比例在１９～３１℃时高达６０％以上，传病潜能极大。     

靶向多药耐药基因mdr1 RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 构建靶向人多药耐药基因mdr1的microRNA(miRNA)干扰表达载体并进行鉴定. 方法 设计并合成4对编码mdr1 pre-miRNA的单链寡核苷酸,退火成双链后将其连接入miRNA干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR,构建成重组质粒,酶切并测序鉴定其正确性. 结果 获得的重组质粒经酶切测序证实其插入片段大小与预期相符,序列完全正确. 结论 成功构建了4个靶向mdr1的miRNA干扰载体.     

非小细胞肺癌及癌旁组织中血管内皮生长因子C 及其受体mRNA的表达与临床意义

非小细胞肺癌(NSCLC)转移依赖于肿瘤局部血管生成的理论已经得到证实，而事实上NSCLC似乎更易于经淋巴道转移。由于缺乏明确的淋巴管生成因子和标记因子，对淋巴转移的研究进展缓慢，血管内皮生长因子(VEGF)C是迄今发现的惟一淋巴管内皮细胞刺激因子。有研究显示，多种恶性肿瘤中VEGF-C高表达，并且和肿瘤的淋巴转移正相关。