ATP-TCA在大肠癌化疗药物敏感性检测中的应用

目的:评估ATP-TCA肿瘤药敏检测法指导制定大肠癌化疗方案的可行性。方法:应用ATP-TCA肿瘤药敏检测法,检测28例大肠癌手术标本和19例大肠癌外周血标本对8种常用抗肿瘤药物的敏感性。结果:大肠癌对抗癌药物的敏感程度存在着异质性,联合用药的敏感率高于单药。外周血标本和手术标本检测结果具有一致性,检测结果与临床疗效基本相符。结论:ATP-TCA肿瘤药敏检测法可用于临床制定大肠癌个体化的化疗方案。     

ELISA方法研究多糖与人干扰素-γ相互作用

目的:建立一种体外研究多糖与干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)相互作用的ELISA方法.方法:在硼氰氢化钠作用下合成肝素-牛血清白蛋白复合物(Heparin-BSA Complex,HBC),Sepharose 4B凝胶过滤系统分离纯化HBC,并用SDS-PAGE鉴定.将HBC(相当于0.5 μg蛋白含量)包被在酶标板上,ELISA方法检测HBC与IFN-γ的相互作用,并探讨游离肝素、低分子量肝素、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和透明质酸,以及卡拉胶等多糖对这种结合的影响.结果:IFN-γ与HBC的结合呈IFN-γ剂量依赖性,2 ng左右达到饱和.游离肝素和低分子量肝素以及其他多糖均不同程度地抑制了IFN-γ与HBC的结合,肝素和低分子肝素的IC50分别为2.4 μg/ml和18.6 μg/ml.结论:IFN-γ与肝素、卡拉胶高亲和力结合,而与硫酸软骨素A、硫酸软骨素C、透明质酸结合力极弱.ELISA是一个简单、灵敏的研究细胞因子与多糖相互作用的方法.     

烧伤科同期存在铜绿假单胞菌两种流行株传播

目的了解烧伤科分离铜绿假单胞菌(PAE)的同期流行情况。方法对2006年1月-2007年12月烧伤科分离的32株PAE采用PCR及序列分析的方法,分析44种耐药基因,Average法进行耐药基因聚类分析以确定菌株亲缘性。结果 32株PAE中,基因阳性率分别为TEM 100.0%、OXA-10 28.1%、VEB 25.0%、IMP25.0%、VIM 9.4%、oprD缺失100.0%、aac(6′)-Ⅰb 9.4%、aac(6′)-Ⅱ3.1%、ant(3″)-Ⅰ28.1%、ant(2″)-Ⅰ25.0%、rmtB1 3.1%、qacE△1-sul1 50.0%、tnp513 9.4%、tnpA 6.2%、merA 34.4%和intⅠ1 40.6%,其他基因均阴性;根据耐药基因聚类分析32株PAE分为2群,为烧伤科该时期存在的主要流行株。结论烧伤科分离的32株PAE,检测到16种耐药基因,主要有2种流行株传播,可导致克隆传播医院感染,存在暴发流行的趋势。     

RNAi沉默RON基因对人结肠癌HT-29细胞侵袭和耐药性的抑制作用

目的:探讨RNAi沉默酪氨酸激酶受体RON(recepteur d'origine nantais)基因对人结肠癌HT-29细胞侵袭和对抗肿瘤药物敏感性的影响.方法:构建RON基因的RNAi慢病毒载体Lv-RON-siRNA.Real-time PCR和Western blotting检测RON基因的沉默效率及RON蛋白表达水平;Transwell侵袭实验和ATP-TCA(ATP-tumor chemosensitivity assay)检测RON基因对HT-29细胞侵袭和对药物敏感性的影响.结果:慢病毒载体Lv-RON-siRNA感染HT-29细胞对RON基因的沉默效果达到70％.Lv-RON-siRNA感染后,HT-29细胞侵袭力较对照组明显降低(0.97±0.072 vs 1.29±0.076,P＜0.05).Lv-RON-siRNA感染后,HT-29细胞对5-氟尿嘧啶(5-fluorouraci,5-FU)的IC90值和IC50值分别为(14.28 ±1.34)、(8.93±1.20) μg/ml,顺铂(cisplatin,DDP)的IC90值和IC50值分别为(1.91±0.22)、(0.64±0.07) μg/ml,均明显低于对照组(P＜0.01).结论:沉默RON基因表达能抑制HT-29细胞的侵袭力,提高细胞对5-FU和DDP的敏感性.     

慢病毒载体介导RNA干扰抑制大肠癌细胞HT29的酪氨酸激酶受体RON基因的表达

目的研究慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)对大肠癌细胞RON基因的干扰效率,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株。方法应用实时聚合酶链反应(PCR)检测大肠癌细胞DLD-1、HCT116、LOVO、RKO、SW480、HT29的RONmRNA表达情况,筛选出表达丰度能满足RNAi的大肠癌靶细胞HT29。根据人RON基因序列,构建4种慢病毒载体质粒pGCSIL/RON-短发夹RNA(shRNA),转染包装细胞293T,获得4种重组慢病毒pGCSIL/RON-shRNA,分别感染HT29细胞。应用实时PCR检测各组HT29细胞RONmRNA表达情况,筛选出RON干扰效率最高的一种shRNA慢病毒载体质粒,构建RON基因稳定沉默的大肠癌细胞株HT29/RON-shRNA。结果 DLD-1、HCT116、RKO、SW480、HT29细胞RON表达丰度能满足RNAi的需要,选择HT29细胞作为RNAi的靶细胞。阴性对照病毒感染的细胞样品相对正常未感染病毒的细胞目的基因的相对表达水平为(94±5)%,RONshRNA-1靶点病毒感染的细胞为(86±5)%,RONshRNA-2靶点病毒感染的细胞为(67±6)%,RONshRNA-3靶点病毒感染的细胞为(63±6)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞为(30±8)%,RONshRNA-4靶点病毒感染的细胞的表达水平显著低于其他细胞(P值均<0.01),其对目的基因的沉默效果达到(70±8)%。结论慢病毒介导RNAi能显著抑制大肠癌细胞HT29的RON基因的表达,慢病毒载体介导的RNAi是一种高效的"基因沉默"的手段。     

铜绿假单胞菌烧伤患者分离株qacE△1-sull基因检测及临床意义

目的 了解分离自烧伤病房患者的铜绿假单胞菌中消毒剂-磺胺耐药qacE△1-sull基因的存在状况.方法 采用GNS-448药敏卡及K-B法测定抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应(PCR)测定qacE△1-sull基因并进行序列分析.结果 32株铜绿假单胞菌对氨苄西林、头孢呋辛、头孢西丁、复方新诺明完全耐药,对阿米卡星的敏感率最高为68.0%,对庆大霉素的敏感率为46.9%,而对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别达到68.8%、59.4%;16株(50.0%)qacE△1-sull基因阳性.结论 分离自烧伤患者的铜绿假单胞菌耐药严重,qacE△1-sull基因携带率较高.     

脉冲场凝胶电泳与多基因聚类分析在铜绿假单胞菌株亲缘性研究中的应用

目的:了解分离自临床铜绿假单胞菌分子流行病学特性及菌株亲缘性。方法:对分离自临床的32株铜绿假单胞菌采用Kirby-Bauer法测定抗菌药物的敏感性;利用脉冲场电泳和多耐药基因聚类分析菌株的亲缘性。结果:32株铜绿假单胞菌中有17株对8种以上抗生素耐药,占53.1%,8株(25%)铜绿假单胞菌对检测抗生素全部耐药,为同一耐药表型。脉冲场电泳聚类分析显示,铜绿假单胞菌主要为3个克隆株;而多耐药基因聚类分析显示,铜绿假单胞菌主要为2个簇群,二个簇群内已发生衍化,存在3个克隆传播。结论:分离自临床的铜绿假单胞菌耐药严重,亲缘性分析中多基因聚类分析法分辨率高于脉冲场电泳。     

靶向干扰CDK2AP1对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响

目的：探讨靶向干扰细胞周期调节蛋白依赖性激酶2-关联蛋白-1（CDK2AP1）对乳腺癌MCF-7细胞体外迁移和侵袭的影响。方法构建重组慢病毒 pGCLV- CDK2AP1- shRNA及重组空病毒pGCLV- GFP,分别稳定转染乳腺癌细胞系MCF-7,获得乳腺癌细胞株 MCF-7/RNAi- NC 和 MCF-7/RNAi- CDK2AP1。采用定量 PCR 法检测两组 MCF-7细胞株的CDK2AP1mRNA表达,xCELLigence/RT- CIM实时细胞电子分析系统检测细胞迁移能力,Transwel 实验检测细胞的侵袭能力。结果成功构建乳腺癌细胞株MCF-7/RNAi- NC和MCF-7/RNAi- CDK2AP1,相比MCF-7/RNAi- NC细胞组,MCF-7/RNAi- CDK2AP1细胞组的CDK2AP1mRNA表达受到明显抑制,其细胞迁移和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）。结论乳腺癌细胞MCF-7中CDK2AP1低表达能有效抑制细胞的体外迁移和侵袭能力。     

重组人绒毛膜促性腺激素-β亚基的纯化及生物活性测定

目的 构建人绒毛膜促性腺激素（HCGB）原核表达载体PG5-HCGβ，使HCGβ在大肠杆菌中获得高效表达。建立一条简单、快速、高效的纯化复性路线，获得具有生物活性的高纯度rHCGβ。方法以本室克隆的PCRII／HCGB为模板，构建PG5-HCGβ，转化大肠杆菌BL21表达HCGβ。表达蛋白顺次用凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化。结果酶切及序列结果显示，PG5-HCGβ构建正确，HCGβ表达约占菌体总蛋白的20％。经过凝胶过滤和离子交换层析两步分离纯化，获得rHCGβ纯度达95％以上。复性的rHCGβ具有促进小鼠子宫生长的生物学活性。结论构建的PG5-HCGβ表达载体在大肠杆菌中获得高效表达，纯化复性的rHCGβ蛋白具有较高的生物学活性，为今后的rHCGβ生产打下了良好的基础。     

自杀基因ePNP的克隆及在人肝癌细胞HepG_2的表达

目的构建含大肠杆菌的嘌呤核苷酸磷酸化酶（ePNP）DNA的重组逆转录病毒载体,观察ePNP基因在人肝癌细胞株HepG2的表达。方法用PCR法获得ePNP亚克隆,构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP,鉴定测序。脂质体法将逆转录病毒载体pDsRed-ePNP转染AmphoPackTM-293包装细胞,获得高滴度病毒并感染HepG2细胞。流式细胞术和荧光显微镜检测红色荧光蛋白（RFP）的表达。RT-PCR法检测ePNPmRNA的表达。ATP-生物荧光体外检测实验（ATP-TCA法）检测不同浓度Fludarabine对HepG2、HepG2/pDsRed和HepG2/ePNP细胞的杀伤作用。结果克隆的ePNP基因与文献报道一致,成功构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP。病毒包装后滴度为5E＋4TU/mL。表达RFP的HepG2/ePNP阳性细胞率为97.1%。HepG2/ePNP细胞稳定表达ePNP。低浓度Fludarabine对HepG2/ePNP细胞毒效应明显。结论成功构建重组逆转录病毒载体pDsRed-ePNP,并且获得稳定表达ePNP基因的HepG2/ePNP人肝癌细胞株。