哺乳类内耳毛细胞的发育和再生研究的最新进展

哺乳类内耳的形态生成和毛细胞的产生是由局部的细胞问相互影响及特异的基因所调控。尤其是特别的“碱性螺旋-环-螺旋”(basic helix—loop-helix，bHLH)基因转录调控因子对于毛细胞的分化是至关重要的。例如果蝇atonal的鼠类同源基因Mathl已被证明是毛细胞分化的一个正向调控因子，而Hes1和Hes5则起着负向调控的作用。这些bHLH     

阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者3种GPI锚定蛋白表达的改变

目的 比较阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者血细胞表面3种糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白表达情况。方法 流式细胞术检测25例PNH患者粒细胞表面GPI锚定蛋白CD55、CD59和CD87的表达水平，并分析它们在不同疾病状态下的改变。结果 PNH患者粒细胞表面3种GPI锚定蛋白间具有较好的相关性(P均＜0．05)，红细胞表面CD55和CD59也表现出相关(P＜0．01)，但与粒细胞表面CD55和CD59的缺乏情况并不一致。结论 PNH患者同一系血细胞表面GPI锚定蛋白呈平行关系，这有助于对PNH发病机制的进一步了解。     

Rsa Ⅰ与Sma工多态性寡核苷酸阵列检测法的建立及其与血栓性疾病的相关性研究

目的建立血管性血友病因子(vWF)基因Bsa Ⅰ、Sma Ⅰ多态性寡核苷酸阵列检测方法,对基因芯片在单核苷酸多态性(SNP)检测上的应用进行探讨;研究两位点多态性与血栓性疾病的发生有无相关关系.方法设计、合成两组寡核苷酸探针,使用3甲氧基氨基丙基硅烷、戊二醛等化学物质,实现探针与固相支持物玻片的连接.应用不对称PCR方法扩增Rsa Ⅰ、Sma Ⅰ多态性片段,在扩增体系中掺入荧光标记dUTP,获得被测片段的单链标记产物.对核酸杂交反应的温度、动力学和离子浓度变化进行研究,获得最佳的杂交鉴别条件.对20名正常人,酶切法确定多态性基因型,再用寡核苷酸阵列法检测,以验证该方法的准确性.使用该方法对50例血栓病人进行检测,探讨血栓性疾病的发生与vWF基因Rsa Ⅰ、Sma Ⅰ多态性的关系.结果寡核苷酸阵列法和酶切法对20例标本检测的符合率为100%;血栓病人与正常人Bsa Ⅰ、Sma Ⅰ两位点多态性的基因型GG、GA、AA和CC、CT、TF分别为4.0%、12.0%、84.0%和24.0%、44.0%、32.0%,正常人分别为1.4%、11.8%、86.8%和8.8%、57.4%、33.8%,血栓病人等位基因频率G、A和C、T分别为10.0%、90.0%和46.0%、54.0%,正常人分别为7.4%、92.6%和37.5%、62.5%,血栓病人与正常人之间两位点多态性的基因型和等位基因频率的差异均无显著意义(P>0.05).结论成功建立vWF基因RsaⅠ、Sma Ⅰ多态性寡核苷酸阵列检测方法,为基因芯片技术在SNP检测上的应用提供依据.未获明确证据表明Rsa Ⅰ、Sma Ⅰ多态性与血栓的发生有关.     

血管性血友病因子裂解酶活性域的表达及其单克隆抗体的制备

血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)是一种新发现的金属蛋白酶,与血栓性微血管病的发生密切相关。本研究应用IPTG从pET28a( )-vWF-cp/MD质粒中诱导表达了vWF-cp的金属蛋白酶域,重组蛋白经Ni-NTA柱纯化,复性后免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了稳定分泌抗vWF-cp金属蛋白酶域抗体的细胞株,进一步对其单克隆后,收集细胞接种于小鼠腹腔产生腹水,鉴定所获得的单克隆抗体,同时,利用单克隆抗体确定vWF-cp在组织细胞中的位置及其在各种正常组织中的表达情况。结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的28%。利用杂交瘤技术制备出3株抗vWF-cp单克隆抗体,对其中2株单克隆抗体作了进一步的鉴定。免疫双扩散和竞争ELISA结果显示,它们均属IgG1亚类,腹水中的含量约为4mg/ml,效价达1×10-5,而且识别vWF-cp金属蛋白酶域不同的表位。Westernblot和免疫沉淀结果表明,2株单克隆抗体能够识别重组蛋白和正常血小板中200kD的蛋白。在组织细胞中,2株单克隆抗体识别的蛋白位于细胞胞质内,而且在多种正常组织如肝、前列腺和卵巢等组织中表达,但脑组织中无该蛋白的表达。结论:本研究为了解vWF-cp在组织中的分布以及进一步研究该蛋白酶的结构和功能奠定了基础,并且可用所制备的单克隆抗体建立vWF-cp抗原的检测方法。     

汉族正常人群与血栓性疾病患者vWF裂解酶C1423T基因多态性调查

目的　研究我国汉族人群中血管性血友病因子裂解酶 (vWF cp)基因C14 2 3T多态性的分布频率及其与血栓性疾病的相关性。方法　应用PCR技术结合酶切分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳研究来自我国三个不同地区 4 0 0名汉族人vWF cp中C14 2 3T多态性的分布特点。同时 ,根据病例对照研究 ,比较了健康对照和血栓性疾病患者中该多态性的分布频率。结果　我国汉族人群中C14 2 3T的基因频率分别为 98.5 %和 1.5 % ,总理论杂合率为 2 .96 % ,不同地区人群杂合率不同 ,但未发现 14 2 3T T纯合子。该多态性的基因型与基因频率在健康对照和血栓性疾病患者中相似。结论　vWF cp基因C14 2 3T多态性在我国汉族人群中频率较低 ,尽管它影响vWF cp的酶活性。     

人vW因子A2区基因表达及其生物学活性的研究

血管性血友病因子（vWF）在血管性血友病（vWD）以及血栓性血小板减少性紫癜（TTP）的发病中起着重要的作用,并受血浆vWF裂解蛋白酶（ADAMTS-13）的调节.本研究表达vWF中的A2区蛋白,并研究ADAMTS-13对其裂解活性.首先,应用基因重组技术在大肠杆菌中表达人vWF-A2区蛋白,经纯化、复性获得重组蛋白（rvWF-A2）,并与正常人以及TYP患者血浆进行反应,分析rvWF-A2蛋白的生物学活性.结果表明：重组表达载体pQE-30-vWFA2在大肠杆菌M15中得到高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的42%,Ni-NTA agrose柱层析纯化后,其纯度为98%,经复性的rvWF-A2可作为ADAMTS-13良好的酶解底物,可被枸橼酸钠抗凝的正常人血浆切割,其切割程度随时间的延长而增加,而EDTA抗凝的正常人血浆以及TTP患者血浆无法切割此蛋白.结论：在大肠杆菌中高效表达的rvWF-A2具有良好的生物学活性,为建立定量测定ADAMTS-13活性的方法奠定了坚实的基础.     

肿瘤患者胸水可溶性尿激酶受体检测及其临床意义

目的　了解良、恶性胸水中可溶性尿激酶受体 (suPAR)的水平及其与肿瘤患者病情和预后的关系。方法　放射免疫分析法检测 2 6例恶性胸水及 10例炎性胸水患者suPAR水平 ,并与 2 1名正常人 (对照组 )对照。结果　恶性胸水、炎性胸水与正常血浆suPAR水平分别为 (4 .3 6±2 .12 ) μg/L、(2 .64± 1.0 5 ) μg/L和 (1.73± 0 .96) μg/L ,炎性胸水suPAR水平高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,而恶性胸水suPAR水平又高于炎性胸水 (P <0 .0 5 )。恶性胸水suPAR水平还显示出与患者预后相关。结论　检测suPAR水平有助于鉴别胸水的良、恶性及判断恶性肿瘤患者的预后     

超声弹性成像与彩色能量多普勒在鉴别乳腺肿块中的临床应用

目的 探讨超声弹性成像与彩色能量多普勒在鉴别乳腺肿块良恶性中的应用价值.方法 72例乳腺肿块病人(87个病灶),术前经超声弹性成像及彩色能量多普勒超声检测,并给予相应评分,和术后病理结果对比分析.结果 彩色能量多普勒检测乳腺肿块恶性的阳性率高于超声弹性成像.结论 超声弹性成像能够依据乳腺肿块的相对硬度判断乳腺肿块的良恶性质,彩色能量多普勒依据乳腺肿块内的血流丰富程度判断其良恶性质,二者联合应用能够提高超声检查判断乳腺肿块良恶性的准确度.     

von Willebrand因子裂解酶活性水平的检测及其临床应用

血管性血友病因子裂解酶 (vWF cp)是新近发现的一个金属蛋白酶 ,其活性在多种生理病理状态下发生改变。为了研究vonWillebrand因子裂解酶活性检测及其临床应用 ,用ELISA法检测了vWF cp酶解前及裂解后血清 (浆 )中血管性血友病因子 (vWF)的胶原结合能力 ,两者之比作为该待测血清 (浆 )的相对vWF cp活性水平。同时观察血栓性血小板减少性紫癜 (TTP)患者与肿瘤患者体内vWF cp活性的改变。结果表明 ,该方法准确测出了87名健康成人和 79例患者血样的残余胶原结合力 (R CBA) ,批内变异和批间变异分别为 3.6 0 % (n =9)和 8.35 %(n =5 )。 5 3名健康成人血清vWF cp活性水平为 (79.4 7± 10 .78) % ,30名健康成人血浆vWF -cp活性水平为(78.79± 9.17) %。 6例TTP患者中 5例血浆vWF cp活性水平显著降低 ,2 5例良性肿瘤患者血清vWF cp水平轻度降低 ,4 9例恶性肿瘤患者则明显下降 (P值分别小于 0 .0 0 1,0 .0 3和 0 .0 0 1)。结论 :以R CBA检测vWF cp活性水平简单易行 ,可应用于临床检验。恶性肿瘤患者 ,尤其是TTP患者血浆 (清 )vWF cp活性水平显著降低。     

血管性血友病因子裂解酶金属蛋白酶域的克隆和表达

目的:克隆和表达血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)的金属蛋白酶域。方法:应用PCR从含有人vWF-cp金属蛋白酶域的质粒中扩增出该区域,克隆至pUC18载体后行序列分析,并将其重组于带有6×HisTag的融合蛋白表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌DE3／plySs中诱导表达。融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,采用Westernblot印迹鉴定。结果:PCR扩增得到658bp的vWF-cp金属蛋白酶域的基因片段,测序结果与GenBank序列一致。重组表达质粒经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导5h后表达的融合蛋白占菌体总蛋白的28％,进一步纯化后其纯度在95％以上。结论:在大肠杆菌中高效表达了人vWF-cp的金属蛋白酶结构域,为深入研究vWF-cp结构与功能的关系奠定了基础。