强直性脊柱炎并发虹睫炎易感性与LMP2和LMP7基因多态性的探讨

目的　研究LMP基因多态性与强直性脊柱炎并发虹睫炎发病的关系.方法　应用PCR对正常人和病人进行HLA-B27检测以及LMP2和LMP7扩增.CfoI进行限制性酶切图谱分析.结果　强直性脊柱炎有虹睫炎(AS+AAU)病史以及单纯虹睫炎(AAU)患者LMP2基因BB纯合型较正常人以及强直性脊柱炎(AS)患者明显增高(P＜0.05).AS+AAU患者BB型OR＝3.6,AAU患者BB型OR＝5.83.LMP7基因多态性无明显差别.结论　在我国汉人中,LMP2基因多态性与AS+AAU以及AAU发病存在明显相关关系.     

IL-2诱导类风湿关节炎与骨关节炎T淋巴细胞STAT3 STAT5酪氨酸磷酸化状态的比较

目的观察白细胞介素(IL)-2作用于类风湿关节炎(RA)与骨关节炎(OA)外周血T淋巴细胞前后,T淋巴细胞中STAT3及STAT5的酪氨酸磷酸化活化状态,并进行比较.方法从RA与OA患者的外周血中分离培养单个核细胞,继而纯化得到T淋巴细胞,静息后,用重组人IL-2刺激,在各时相裂解细胞,收获提取蛋白,进行Western blot分析.结果在静息后,RA与OA的外周血T淋巴细胞中STAT3与STAT5均处于极低水平磷酸化的状态;在IL-2作用后,T淋巴细胞中STAT3和STAT5发生时相性的酪氨酸磷酸化,而RA的T淋巴细胞磷酸化程度较OA显著增高.结论IL-2对RA患者T淋巴细胞的STAT3和STAT5过度激活,引起T淋巴细胞中IL-2信号传导的异常放大效应,可能在RA的发病过程中发挥重要作用.     

细胞因子诱导破骨细胞分化的2种实验模型的建立

目的探讨体外从单个核细胞诱导分化形成破骨细胞的2种不同方法,建立研究细胞因子对破骨细胞分化作用的2种不同实验模型。方法外周血单个核细胞在10-8mol/L LTB4和25μg/LM-CSF刺激下,经过2周的直接诱导分化;外周血单个核细胞与RAFLs共培养,加入10-8mol/L LTB4和25μg/L M-CSF,经过3周的间接诱导分化,用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞样细胞(OCL)。结果通过直接分化和间接分化均可形成破骨细胞样细胞。结论2种不同实验模型能分别用于研究细胞因子对破骨细胞的直接和间接分化作用。     

趋化素样因子1在类风湿关节炎滑膜中的表达研究

目的研究趋化素样因子1(CKLF1)在类风湿关节炎(RA)滑膜中的表达,探讨CKLF1在RA发病过程中的可能的病理作用。方法取35例RA,20例骨关节炎(OA)及20例半月板损伤患者手术切除的膝关节滑膜标本。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测CKLF1在上述3种病变滑膜中的mRNA水平表达水平。采用免疫组织化学方法检测CKLF1在滑膜组织中的蛋白水平表达特征。结果RA滑膜组织中CKLF1在mRNA水平的表达(0．41±0．17)明显高于OA(0．07±0．06)和半月板损伤患者(0．16±0．10)(P<0．05)。免疫组织化学结果显示,OA病例中仅有2例显示少量滑膜衬里层细胞着色,半月板损伤病例仅有5例显示少量滑膜衬里层细胞着色。在RA滑膜中20例染色强阳性,10例染色阳性,5例染色阴性。阳性染色颗粒位于细胞胞质内,阳性细胞定位在滑膜衬里层的成纤维细胞、滑膜下层大量的浆细胞以及增生的血管上皮细胞。结论CKLF1基因在RA滑膜中有高水平的表达特征,为进一步深入研究RA的发病机制提供新的研究思路。     

程序化细胞死亡因子5过表达促进雷公藤内醇酯诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

目的:探讨程序化细胞死亡因子5(progrmmed cell death 5,PDCD5)过表达对雷公藤内醇酯(triptolide)诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatiod arthritis fibroblast-likes synoviocytes,RA FLS)凋亡的作用.方法:体外分离培养RA FLS进行腺病毒Ad-PDCD5(含有PDCD5基因的腺病毒载体)的转染,分别用免疫印迹法和流式细胞术检测Ad-PDCD5转染后的RA FLS中PDCD5蛋白表达及经雷公藤内醇酯处理后的PDCD5蛋白过表达的RAFLS的凋亡率.结果:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别为50、100、200和300的Ad-PDCD5感染RAFLS 36 h后,PDCD5蛋白表达水平呈现剂量依赖性增加.未经雷公藤内醇酯处理的非感染组、Ad-null组(不含目的基因的空载体)和Ad-PDCD5组RA FLS的凋亡之间差异无统计学意义,经雷公藤内醇酯处理后,其RA FLS的凋亡率分别为(22.51±3.87)%,(28.77±12.97)%和(48.87±12.69)%.表明此腺病毒体系能够有效地使PDCD5蛋白过表达,在RA FLS中,单独使用雷公藤内醇酯或者单独转染PDCD5都不能明显地诱导细胞凋亡,但过表达PDCD5再进行雷公藤内醇酯处理可以诱导细胞凋亡.结论:腺病毒Ad-PDCD5转染使PDCD5过表达,从而能够促进雷公藤内醇酯诱导的RA FLS凋亡,为类风湿关节炎的临床治疗提供了一个可能的干预靶点.     

中国人群HLA－B＿（27）等位基因亚型与强直性脊柱炎的相关性研究

利用聚合酶链式反应和顺序特异性寡核苷酸探针斑点杂交方法，对７８例中国汉族强直性脊柱炎（ＡＳ）病人ＨＬＡ－Ｂ２７，基因分析结果显示，该基因与ＡＳ易感性显著相关，在中国汉族ＡＳ病人中至少存在两种亚型，其中Ｂ２７４０亚型频率最高（占５４．８％），其次Ｂ２７０５（占４１．１％）。实验结果表明，不同人种ＡＳ患者的Ｂ２７亚型分布频率不同；与强直性脊柱炎相关的可能是各亚型共有的序列特征，即Ｂ２７特异性抗原决定基而与各亚型特异性序列特征无关。     

HLA-B2704转基因小鼠模型的建立

目的　制备HLA B2 70 4转基因小鼠。方法　应用显微注射将HLA B2 70 4基因注入C5 7BL/6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵 ,出生动物及其后代经PCR初筛 ,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性标本作进一步鉴定和整合基因拷贝数测定 ,阳性者行免疫组化染色和流式细胞术检测HLA B2 70 4蛋白表达水平。结果　 10只仔鼠 (首建转基因鼠 ,founder)表达有HLA 2 70 4基因。由注射基因后移卵出生的 10 1只小鼠中 ,C5 7BL/6×昆明鼠杂种 3 7只 ,阳性 7只 ( 18 9% ) ,昆明鼠×昆明鼠杂种 64只 ,阳性 3只 ( 4 7% ) ,阳性动物外周血淋巴细胞、皮肤和胃肠道上皮细胞内均有HLA B2 70 4蛋白表达。结论　应用C5 7BL/6和昆明鼠成功建立了HLA B2 70 4的转基因小鼠。与昆明鼠×昆明鼠F1代相比 ,C5 7BL/6×昆明鼠F1代更适合用于转基因动物制备。     

类风湿关节炎滑膜组织中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的研究

目的研究类风湿关节炎(RA)患者滑膜组织中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMM-PRIN)的表达,探讨其在RA致病中的作用。方法对20例RA患者膝关节滑膜组织标本采用免疫组织化学染色和半定量反转录-聚合酶联反应(RT-PCR)法,观察RA滑膜组织中EMMPRIN的蛋白及mRNA表达。10例骨关节炎OA滑膜作为对照。结果RA滑膜内衬层的单核细胞、成纤维细胞中EMMPRIN阳性表达广泛,RA组EMMPRIN的免疫反应明显强于对照组(P<0.01)。14例RA、2例OA滑膜标本EMM-PRINmRNA表达阳性,EMMPRINmRNA表达水平RA也明显高于OA组。结论滑膜中过度表达的EMMPRIN通过上调MMPs促进关节软骨的破坏。因此选择性地抑制EMMPRIN生物活性,可能是治疗RA的新途径。     

沙利度胺对骨水泥微粒刺激巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子的影响

目的 :检测沙利度胺 (Thalidomide ,Thal)对骨水泥微粒刺激巨噬细胞 (Macrophage ,MФ)分泌肿瘤坏死因子a (TumorNecrosisFactor α ,TNF α)的影响 ,探讨药物防治人工关节无菌性松动的可能性。方法 :运用电镜检测MФ吞噬骨水泥微粒的情况 ,MTT方法检测MФ吞噬骨水泥微粒后自分泌物对其增殖的影响 ,分别运用RT PCR、固定化蛋白质印迹法 (Westernblot)及酶联免疫法 (ELISA)检测Thal对接受骨水泥微粒刺激后MФTNF α分泌水平的影响。结果 :电镜证实MФ具有吞噬骨水泥微粒的能力 ,MTT法证实MФ接受骨水泥微粒刺激后分泌的物质对其自身具有促增殖作用 ,且具有剂量依赖性。RT PCR、Westernblot及ELISA方法证实Thal能够在mRNA转录、蛋白表达、细胞因子分泌等多个水平对TNF α具有抑制作用。结论 :骨水泥微粒可刺激MФ增殖和TNF α分泌 ,而Thal能有效地抑制MФ的这种分泌。Thal有可能对由碎屑微粒诱导并由TNF α介导的骨溶解产生抑制作用。     

人β2m转基因小鼠的制备、筛选及鉴定

目的:制备人β2m转基因小鼠,研究HLA-B2704的表达.方法:应用显微注射将人β2m基因注入C57BL/6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵,出生动物及其后代经PCR筛选,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定和测定整合拷贝数,利用RT-PCR检测阳性鼠中人β2m转基因的表达.结果:6只原代仔鼠及7只它们的下一代(F1)带有人β2m基因.由微注射基因后移卵出生的86只小鼠中,C57BL/6×昆明鼠杂交仔鼠35只,其中4只阳性(11.4%),昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠51只,其中2只阳性(3.9%),含有人β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠20只,其中7只阳性.整合的转基因均为单拷贝.Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合.阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达.结论:在转基因动物制备中,C57BL/6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代.与人HLA-B2704基因相比,人β2m基因不易整合,其整合率与整合拷贝数均较低.得到的人β2m转基因小鼠能够将人β2m基因传给下一代并可与人HLA-B2704转基因鼠交配.