人端粒酶逆转录酶在肿瘤免疫治疗中的应用

寻找有效的抗原表位是近期肿瘤免疫治疗的热点．人端粒酶逆转录酶(hTERT)的免疫学特性使其成为肿瘤免疫治疗中一个吸引人的目标。从人和鼠系统获得的数据证实，细胞毒淋巴细胞(CTL)能识别hTERT特异的肽并杀死多种组织类型hTERT表达的肿瘤细胞。由于hTERT在人肿瘤组织中的广泛表达，在极少正常组织的低水平表达，临床试验已开始检验将hTERT作为肿瘤免疫治疗目标的可行程度。近期树突状细胞(DC)转运系统及其相关技术的发展和成熟提供了一个快速有效筛选抗原肽的方法。     

γ-干扰素基因修饰人肝癌细胞的免疫原性研究

目的研究ＩＦＮ－γ基因修饰后人肝癌细胞的免疫原性。方法利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ分别建立了四种ＩＦＮ－γ基因修饰人肝癌细胞，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交进行鉴定分析，流式细胞仪（ＦＡＣＳ）分析细胞表面ＭＨＣ分子表达，灭活肿瘤细胞体外刺激诱导细胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）产生。结果Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明，ＩＦＮ－γ基因在宿主细胞中获得了正确整合和表达。ＦＡＣＳ分析结果表明，ＩＦＮ－γ基因修饰后人肝癌细胞表面ＨＬＡⅠ类分子表达强度显著增强，Ⅱ类分子的表达阳性百分率有显著提高。一些ＩＦＮ－γ基因修饰人肝癌细胞在体外诱导细胞毒Ｔ淋巴细胞的能力有所提高。结论ＩＦＮ－γ基因修饰可增强人肝癌细胞的免疫原性，为基因工程瘤苗的临床应用提供了一定依据。     

正常和窒息新生儿脐血浆非蛋白结合铁的比较

目的建立用于临床的血浆非蛋白结合铁(NPBI)的测定方法,并比较正常和窒息新生儿脐血浆NPBI值.方法选取正常和窒息新生儿各10例,分别用校正和传统博来霉素法测定其脐血浆NPBI含量,并比较它们的标准曲线、回收率和t检验结果.结果用传统博来霉素法测定脐血浆NPBI值,无论在正常还是窒息新生儿均偏低,且其回收率只有32%左右.用校正博来霉素法测定脐血浆NPBI值,则能较好改善其数据,且其回收率达101%左右.经t检验有显著性差别(P＜0.01).结论校正博来霉素法是一种较好的,能实际用于临床的常规测定NPBI的方法.室息新生儿脐血浆NPBI值明显高于正常新生儿,提示在血浆中可能产生较多毒性羟自由基(OH@)而造成组织细胞,尤其是脑组织的损伤.     

鼠内皮细胞抑制素的克隆及在COS-7细胞中的分泌表达

目的从小鼠肝脏中克隆出ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ并在ＣＯＳ－７细胞中分泌表达,为其在肿瘤抗血管基因治疗中的应用打下基础。方法用ＲＴ－ＰＣＲ从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素ｃＤＮＡ并克隆入测序载体ＰＵＣ－Ｔ测序证实后,装入分泌表达载体ｐＳＥＣ－ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,用ＤＥＡＥ－葡聚糖转染ＣＯＳ－７细胞,从ｍＲＮＡ水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达。结果测序结果显示所克隆的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

核基质结合区修饰的附着体载体介导的EGFP基因体外表达

目的 建立一个非病毒介导外源基因高效转移和稳定表达体系.方法 采用EB病毒(EBV)来源的附着体质粒载体,并结合顺式作用元件IFN-MAR构建重组质粒pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR.采用荧光显微镜观察并摄片,FACS及逆转录-聚合酶链反应检测EGFP表达阳性的COS-7细胞比例、荧光表达强度及EGFP基因的转录.通过Southern印迹和质粒还原实验分析质粒DNA在细胞中存在的形式.结果 本实验构建的重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR在转染进入COS-7细胞后以染色体外附着体的形式存在.由于EBVR的存在,可以在体外获得EGFP较长时间的稳定表达.IFN-MAR替代OriP后,仍可在体外获得EGFP的稳定表达.结论 MAR修饰的EBV附着体载体可以在体外获得外源基因高效稳定的表达.     

肿瘤基因治疗的腺病毒策略

 腺病毒载体是目前肿瘤临床试验中使用最为广泛的载体之一。在过去的十几年里，随着人们对腺病毒活动周期的逐步了解，已经开发出了一系列专门针对恶性肿瘤细胞的靶向腺病毒载体。这些载体可以在特定的细胞中表达治疗性基因或进行自主复制，显示了其在肿瘤治疗方面的独特优势。但目前对腺病毒进行的各种改进方式都存在不同程度的缺陷，因此仍需进一步研究。文章讨论腺病毒载体用于肿瘤基因治疗方面的一些基本情况及其在临床应用的潜力。     

过表达Notch1对肿瘤细胞增殖的影响

目的通过在肿瘤细胞内过表达Notch1胞内段活性部分,模拟细胞Notch途径的上调,检测细胞增殖状态的变化。方法利用包含Notch1胞内段的逆转录病毒感染实验细胞。通过CBF-1报告载体检测细胞内Notch信号的激活程度,MTS法检测细胞增殖情况,并对细胞的周期分布进行检测。结果Notch1胞内段的表达引起Notch信号在不同细胞中的上调,并引起Hela和HepG2细胞的增殖抑制和BGC-823细胞的增殖加速,而对Chang细胞的增殖没有明显影响。结论Notch信号的上调能引起不同肿瘤细胞增殖状态的变化,对Notch在肿瘤基因治疗中的应用具有重要意义。     

急性白血病IgH基因重排的研究

对１０５例儿童白血病细胞作了ＩｇＨ基因重排半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）分析，结果显示重排主要见于Ｂ细胞系急性淋巴细胞白血病（阳性率７５．５％）及相关杂合性白血病（ＨＡＬ）中，说明ＩｇＨ基因重排ＰＣＲ分析结果可作为分型指标之一。１５例正常外周血淋巴细胞则无明显条带，说明可以区分克隆性和反应性增生。２２例同时与ＤＮＡ印迹比较，结果相关。５例ＰＣＲ产物序列分析表明序列同源性小，是克隆特异性的。３例动态分析示３例均在完全缓解期测得白血病克隆，说明ＩｇＨ基因重排ＰＣＲ分析可以检测白血病克隆的消长、演变，值得进一步研究。     

肿瘤坏死因子基因转导肿瘤浸润淋巴细胞的初步研究及应用

用单纯疤疹病毒(HSV)的缺陷株作为载体,感染肿瘤细胞治疗脑瘤的研究已取得了不少进展.本文报道将HSV—tk基因转移联合抗瘤药物GCV可使荷脑瘤大鼠长期存活.9L神经纤维肉瘤细胞用HSV载体hrR3转染,hrR3缺乏RNA还原酶,只能在肿瘤细胞中复制而不能在神经细胞中复制存活,同时还携带病毒胸苷激酶(tk)基因,RH105无tk基因,转染hrR3的9L细胞体外培养,加入GCV1μg/ml共孵育,结果发现9L细胞被杀死的数目比单纯感染hrR3的细胞死亡数目增加23%.GCV加到不表达tk基因的RH105载体转染的9L细胞体系中没有杀伤作用.将神经纤维肉瘤9L细胞4×10~4接种到Fischer 344CD大鼠脑前叶,5天后将hrR3载体2×10~7PFU/10μl直接定位注射至脑瘤部位.结果发现hrR3载体治疗可使20%的大鼠存活时间超过5个月,而生理盐水组全部死亡.接种病毒后同时用GCV7.5mg/kg治疗7天,可使48%的荷9T肿瘤细胞的大鼠存活时间超过5个月PH105感染的治疗组大鼠全部死亡,组织化学检查证明外源性的tk基因在肿瘤细     

PA317产生高滴度带有人TNF-α基因逆转录病毒的研究

逆转录病毒介导的基因转移技术要过渡到临床应用，主要解决如何使病毒载体具有高滴度而不具有复制活性．本文旨在探索建立一种合适的方法，能产生高滴度而且是安全的逆转录病毒载体。采用带有人肿瘤坏死因子基因的LXSN载体转染PA317包装细胞，建立产病毒的包装细胞株，结果表明：病毒载体滴度受包装培养液体积和胎牛血清浓度影响：包装细胞在32℃产生的病毒滴度比37℃高，而且比较稳定。产病毒包装细胞和被感染的靶细胞经PCR分析显示．被转染和被转导的细胞都有病毒基因的整合．而且包装细胞不会产生具有复制活性的逆转录病毒，因此能进一步用于临床研究．