分子生物学实验教学的实践与思考

文章讨论了开展分子生物学实验的常见问题，如实验内容更新迅速，实验过程较长，实验教学与理论教学脱节等。并提出在分子生物学实验教学中应重视师资队伍与实验室的建设；明确教学目的选择实验内容，加强教材建设；结合实际调节教学模式与方法，实行创新教育的观点。     

桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布研究

目的:研究桂林地区乙肝患者HBV B基因亚型分布特点,为本地区乙型肝炎的防治提供依据.方法:采用巢式PCR技术扩增乙肝患者HBV的S基因,经测序后与标准序列比对,采用Mega 5.0构建系统树进行基因亚型分型.结果:从120例乙肝病毒患者中鉴定出3个以前报告的乙肝病毒亚型,序列分型B2 104例,占86.7％;B4 1例,占0.8％;B5 1例,占0.8％,其中14例未分出亚型,占11.7％.结论:桂林地区HBV B基因亚型主要以B2为主,其次为B4、B5,未发现B1、B3、B6亚型.     

一种高效扩增人T细胞受体β链可变区基因的方法建立

目的:建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)β链可变区(Vβ)基因的方法.方法:根据TCR Vβ26个亚家族基因序列特点设计扩增Vβ基因的上游内引物34条、上游外引物37条, 并将内、外上游引物各分为8个简并组.在恒定区(C区)设计下游内、外和测序引物各1条以及扩增Cβ基因的上游引物1条.提取细胞RNA, 用PolyA介导反转录后, 采用巢式PCR扩增正常人CD8 T细胞TCR Vβ26个亚家族基因, 并用Jurkat T淋巴瘤细胞作为对照.用T-easy载体克隆RT-PCR 产物, 对克隆基因进行测序.结果:从正常人的CD8 T细胞中扩增到所有TCR Vβ亚家族基因, 克隆后测序与相应的参考序列同源.从Jurkat细胞扩增出TCR Vβ8基因, 经测序验证与文献报道一致, 且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功.结论:建立的巢式RT-PCR方法可以高效、广谱地扩增人TCR Vβ基因, 为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础.     

40例乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因耐药突变分析与表达载体构建

目的 分析40例慢性乙型肝炎患者血清中HBV逆转录酶区基因耐药相关突变,构建突变基因重组表达载体用于表型耐药分析.方法 从服用抗HBV核苷(酸)类似物的患者血清中提取病毒DNA,PCR扩增HBV RT全长基因,克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选3～5个克隆进行DNA序列测定,以DNASTAR软件分析RT基因内与核苷(酸)类似物耐药相关的常见突变位点.用Xho Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切pGEM-Teasy-RT及pTriEx-HBV(C)构建1.1表达载体,测序正确后转染Huh7细胞,检测HBsAg和HBeAg表达水平.结果 40例患者均分别检出拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦耐药相关的单一或联合突变;成功克隆了96条HBV RT基因,分别带有上述核苷(酸)类似物耐药相关变异的序列;挑选主要突变组合形式的40条RT基因构建pTriEx-HBV(C)1.1表达载体,转染Huh7细胞48 h后在培养上清中检测到HBsAg和HBeAg,表明表达载体构建成功.结论 本研究成功进行了临床患者HBV耐药相关突变分析与突变体重组表达载体构建,为进行表型耐药分析打下了基础.     

乙肝病毒截短型中蛋白反式调节作用的研究进展

HBV编码的反式激活蛋白可能是HBV致癌的主要因素之一.研究证实乙型肝炎病毒表面抗原羧基末端截短型中蛋白（MHBsT）是一种具有反式激活作用的蛋白质分子,可调节原癌基因、端粒酶及一氧化氮合酶的表达,影响磷脂代谢并与胰岛素抵抗相关.现就MHBst的研究进展进行综述.     

桂林地区乙肝患者HBV基因型分布及S基因变异研究

目的研究桂林地区HBV基因型分布、S基因突变类型以及基因型与乙肝患者血清标志物、DNA载量和S基因突变位点的相关性。方法用巢式PCR方法扩增乙肝患者HBV的S基因,经测序后与标准序列比对,构建系统树进行基因分型,分析S基因的突变位点并通过对相关氨基酸的分析判断血清型,采用t检验和χ2检验统计分析相关性。结果 84例乙肝患者HBV基因型有B型(59.5%)、C型(40.5%)。B基因型中的血清型有adw1型(84%)、ayw1型(4%)、adrq+型(10%)。C基因型中有adrq+型(88.2%),adw1型(8.8%)。S基因突变位点主要为T126I和T143M/S,突变率分别达34.1%和40.0%。基因型与患者年龄及DNA载量具相关性(P<0.05),与乙肝患者血清标志物及S基因突变位点无相关性(P>0.05)。结论桂林地区HBV基因型主要为B型,其次为C型。血清型主要为adw1型和adrq+型。S基因变异点集中,有形成优势变异株的趋势。     

人亲磷脂酸磷脂酶A1基因的克隆与序列分析及真核表达载体的构建

目的 克隆人亲磷脂酸磷脂酶A1(PA-PLA1)基因,分析该酶基因及其蛋白质的序列特征并构建PA-PLA1基因真核表达载体,为该酶生理功能的研究提供实验依据.方法 从人的肾脏组织中提取总RNA,逆转录制备cDNA.扩增人PA-PLA1基因并克隆测序.以Vector NTI 8.0、DNASTAR、ORF finder分析所克隆的人PA-PLA1基因及其蛋白质序列.构建真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1,测序证实后转染小鼠分泌胰岛素细胞株MIN6,以Western blotting检测PA-PLA1蛋白的表达水平.结果 人PA-PLA1基因mRNA全长为2 923 bp,编码区长2 238 bp,编码1个由745个氨基酸残基组成的蛋白多肽.序列比对表明所克隆的人PA-PLA1基因与牛PA-PLA1基因同源,并与KIAA0725p和p125基因高度相似,三者在脂肪酶家族中形成亚家族,但KIAA0725p蛋白和p125蛋白具有常见的脂肪酶活性中心保守序列GX-S-XG,而PA-PLA1的该序列为SX-S-XG.真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1构建正确并在所转染的MIN6细胞中过表达PA-PLA1蛋白.结论 PA-PLA1、KIAA0725p蛋白和p125蛋白在脂肪酶家族中形成亚家族,但PA-PLA1具有独特的脂肪酶活性中心保守序列SX-S-XG.所构建的PA-PLA1基因真核表达载体能在MIN6细胞中过表达小鼠PA-PLA1蛋白.该研究结果将为PA-PLA1生理功能的研究提供实验依据.     

等位基因特异性PCR检测脂联素基因SNP位点方法的建立

目的:建立等位基因特异性PCR检测脂联素基因与2型糖尿病相关SNP位点的方法.方法:针对脂联素基因G531A,G545C,G11963T,T12194G和T13320C 5个SNP位点设计野生型和突变型特异性引物,第一轮PCR的上游引物或下游引物与等位基因特异性引物进行半巢式PCR.在同一SNP位点如果野生型引物出现扩...     

乙型肝炎病毒对miR-10b表达的影响及其生物信息学分析

目的 应用生物信息数据库分析和分子生物学方法检测乙型肝炎病毒(HBV)对微小RNA(miR-10b)表达的影响,以及生物信息学方法探讨HBV影响的miR-10b异常表达在肝脏疾病中的作用.方法 以GEO2R分析miRNA表达芯片GSE19980中miR-10b的表达水平,荧光定量聚合酶链反应(PCR)验证分析结果.Targetscan、miRTarBase、miRDB和DIANA TOOLS分析miR-10b的靶基因并用韦恩图进行筛选.应用DAVID数据库对miR-10b靶基因数据集进行基因本体(GO)功能富集分析.采用STRING分析软件进行KEGG信号通路分析.GEO2R分析HBV诱导的肝细胞癌及其邻近正常组织的差异表达基因,并与miR-10b靶基因进行韦恩图筛选以获得交集靶基因,然后用STRING分析蛋白质的相互作用,得到miR-10b靶基因的核心蛋白基因.结果 miR-10b在稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞中表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.05);miR-10b靶基因主要富集在转录调控、转录因子活性、参与转录因子复合体等相关蛋白基因;miR-10b的靶基因富集在蛋白多糖、miRNA、cAMP信号通路;miR-10b靶基因编码蛋白的相互关系分析获得CREB1、NCOA6、NCOR2、PIK3CA、GATA3、MAPRE1、TIAM1等核心蛋白,其功能涉及糖稳态调节、炎症、肿瘤发生和发展.结论 HBV上调miR-10b表达,高表达的miR-10b对其靶基因的沉默可能在HBV感染的肝脏疾病中发挥着重要作用.     

开设生物化学设计性实验的实践与思考

该文介绍了解决设计性实验教学中的常见问题,如:如何指导设计性实验的选题、实验方案的设计、实验操作和实验报告的写作以及进行实验评价等经验,提出了教师教学观念的转变是设计性实验成功开设的前提.学校提供良好的实验环境是设计性实验开设的重要保证及教材建设是生物化学设计性实验开设的基础等看法.