EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进IL-8分泌

目的：探讨EB病毒LMP1分子致瘤机制，在已证实鼻咽癌细胞系中LMP1有效激活NF－κB 或AP－1的基础上，对LMP1是否通过NF－κB 或AP－1促进IL－8分泌进行探讨。方法：以稳定表达LMP1及其3种突变体，空白载体的鼻咽癌细胞系[HNE2-LMP1,NHE2-MLP1(1-185),HNE2-LMP1(1-231),HNE2-LMP1Δ187-351和HNF3－pSG5]及antisense-LMP1处理的HNF2－LMP1鼻咽癌的细胞系为材料，将IL－8报道质粒瞬时导入这些细胞系中，通过测定luciferase值以反映LMP1是否促进IL－8转录；将mut AP-1/IL-8-luc或IκB α（S32A／S36A）表达质粒导入HNE2－LMP1细胞系中，比较其IL－8报道活性，以确定LMP1是否通过AP－1或NF－κB 诱导IL－8转录；利用ELISA方法测定HNE2－LMP1，HNE2－pSG5,anti-sese-LMP1处理的HNE2－LMP1鼻咽癌细胞系中的IL－8浓度，进一步从蛋白水平上确定LMP1是否促进IL－8分泌。结果：与HNE2－pSG5相比，在HNE2－LMP1，HNE2－LMP1Δ187－351和HNE2－LMP1（1－231）细胞系中IL－8报道活性分别升高了原来水平的11．5，8．6和3．4倍，而HNE2－LMP1（1－185）对IL－8报道活性不影响。在HNE2－LMP1细胞系中IL－8蛋白水平提高了17．4倍，而antisense-LMP1则使HNE2－LMP1细胞的IL－8报道活性及蛋白水平分别下降到原来水平的18．3％和9．2％，导入mutAP-1/IL-8-luc或IκBα（S32A／S36A）的HNE2－LMP1细胞中IL－8报道活性分别下降到原有水平39％和26％，结论：鼻咽癌细胞系中LMP1可能通过NF－κAP－1促进IL－8表达。     

PCR-ELISA方法在检测结肠癌端粒酶活性中的应用

应用端粒酶ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ法研究１２例配对的结肠癌活检组织的端粒酶活性，发现被检结肠癌组织其端粒酶活性均为阳性，而结肠癌旁组织为阴性或仅表现微弱活性。提示应用端粒酶ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ法检测结肠癌组织的端粒酶活性可作为诊断结肠癌的辅助手段之一。     

D型周期素在鼻咽癌中的表达及功能分析的初步探讨

目的和方法 :肿瘤是一种细胞周期病。Ｄ型周期素是调节细胞周期Ｇ1 /Ｓ期进展的重要正性调节因子 ,包括Ｄ1、Ｄ2及Ｄ3三个亚型 ,尤其是Ｄ1已被证实是一种候选瘤基因。我们先前的研究已首次在鼻咽癌活检组织中建立了Ｄ型周期素的表达谱 ,发现Ｄ型周期素在鼻咽癌活检组织中呈差异性表达。新近的研究表明 ,在Ｂ淋巴细胞中ＥＢ病毒潜伏膜蛋白ＬＭＰ1能诱导Ｄ2的表达 ,协同Ｄ1调节Ｇ1 期行进。因此 ,在此基础上 ,本文利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ方法进一步检测了ＥＢＶ -ＬＭＰ1 ( )及 ( - )的鼻咽癌细胞系ＣＮＥ -ＬＭＰ1、ＨＮＥ1中…     

周期蛋白D1在鼻咽癌细胞系中功能及意义的深入研究

目的 深入研究周期蛋白D1在鼻咽癌细胞中的表达特征及生物学功能。以Western blot方法确定D型周期蛋白在鼻咽癌细胞系中的表达谱及表达水平；利用流式细胞术双参数法，确定cyclin D1在鼻咽癌细胞中的表达分布模式；结合反义硫代磷酸化寡聚脱氧核苷酸和抗体剔除实验，分别从mRNA及蛋白质水平抑制、中和cyclinD1的表达，探讨其在鼻咽癌细胞中的生物学功能。结果 在鼻咽癌细胞中，D型周期蛋白的表达谱为D1、D2、D3均表达型，cyclinD1在两株鼻咽癌细胞均有过表达。cyclinD1在鼻咽癌细胞系中的表达呈细胞周期依赖性，在G0／G1期表达最高，S期及G2／M期下降，但仍可检测到。反义cyclinD1硫代磷酸化寡聚脱氧核苷酸和抗体剔除实验可以有效抑制蛋白质表达，抑制细胞进入S期。结论 鼻咽癌细胞系中，D型周期蛋白的表达谱为D1、D2、D3均表达型,cyclinD1在鼻咽癌细胞中有过表达，且表达呈细胞周期依赖性，cyclinD1可能是鼻咽癌细胞G1／S期进行中必不可少的细胞周期调节因子。     

EB病毒LMP1通过NF-kB介导的HSV-tk/GCV治疗EBV相关肿瘤的研究

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)通过活化NF-kB反式激活HIV-LTR进而启动自杀基困HSV-tk在EBV相关肿瘤治疗中的作用,为进一步开展肿瘤治疗提供科学的实验依据。方法:以鼻咽癌细胞为实验模型,将HSV-tk基因置于HIV-LTR调控序列之下,构建LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk/GCV系统,采用同位素方法检测tk活性来研究LMP1通过NF-kB调控HSV-tk转录的靶向性和表达特征,MTT方法检测在GCV处理下肿瘤细胞的生长状况。结果:成功构建受LMP1调控且依赖于NF-kB的HSV-tk表达质粒,发现其在GCV处理下,表达LMP1的肿瘤细胞的生长有显著的抑制。结论;携带有LMP1-HSV-tk的细胞对GCV治疗高度敏感,显示这一肿瘤治疗系统在EBV相关肿瘤中具有一定的应用前景。     

EB病毒LMP1通过NF-κB介导的HSV-tk/GCV治疗EBV相关肿瘤的研究

目的：研究EB病毒潜伏膜蛋白I(EBV-LMPl)通过活化NF-κB反式激活HIV-LTR进而启动自杀基因HSV-tk在EBV相关肿瘤治疗中的作用，为进一步开展肿瘤治疗提供科学的实验依据。方法：以鼻咽癌细胞为实验模型，将HSV-tk基因置于HIV-LTR调控序列之下，构建LMPl调控且依赖于NF-κB的HSV-tk/GCV系统，采用同位素方法检测tk活性来研究LMPl通过NF-κB调控HSV-tk转录的靶向性和表达特征，MTT方法检测在GCV处理下肿瘤细胞的生长状况。结果：成功构建受LMPl调控且依赖于NF-κB的HSV-tk表达质粒，发现其在GCV处理下，表达LMPl的肿瘤细胞的生长有显著的抑制。结论：携带有LMPl-HSV-tk细胞对GCV治疗高度敏感，显示这一肿瘤治疗系统在EBV相关肿瘤中具有一定的应用前景。     

鼻咽癌细胞中外源性p16表达对CDK4,CyclinD1及pRb的影响

目的 :分析外源性p16表达对CDK4,CyclinD1及pRb的影响 ,探讨其抑制细胞生长的机制。方法 :绘制生长曲线 ,比较细胞倍增时间 ,分析HNE1,# 4 - 2及 # 3- 2克隆中细胞增殖状况 ;利用流式细胞仪分析上述细胞中细胞周期分布的改变 ;结合WesternBlot方法 ,分析外源性p16表达对CDK4,CyclinD1及pRb的影响。结果 :生长曲线示 ,HNE 1倍增时间为 2 3 4h ,# 3- 2和 # 4 - 2分别为 2 8 8h和 31 2h。流式细胞仪示 ,HNE1和 # 3- 2细胞周期无明显差别 (P >0 .0 5 ) ,# 4 - 2细胞G0 /G1期细胞数明显增多 ,S期的细胞数显著降低 (P <0 .0 1和P <0 .0 5 )。WesernBlot示外源性p16表达对CDK4表达水平影响并不显著 ,但下调 # 4 - 2中CyclinD1的表达 ,# 3- 2中CyclinD1的表达反而增强 ;各细胞系均可检测到低磷酸化的pRb ,但在 # 4 - 2 ,# 3- 2中表达强于HNE1及Hela细胞 ;HNE1还可检获高磷酸化的pRb。结论 :外源性p16表达使细胞停滞在G1期 ,抑制细胞生长 ,但其主要机制并非改变CDK4表达水平 ;而对CyclinD1的影响 ,随p16表达水平而变动 ,最终表现为抑制pRb磷酸化。     

EB病毒介导的鼻咽上皮细胞永生化早期阶段的生物学观察

目的 :鼻咽癌是我国南方地区高发的恶性肿瘤之一 ,长期以来 ,对鼻咽癌发病分子机制未能彻底阐明 ,关键问题之一是缺乏一个良好的体外多阶段细胞模型。虽然利用ＥＢ病毒已建立了数个灵长类上皮细胞系 ,但是 ,ＥＢ病毒转化的人鼻咽上皮永生化细胞系尚为空白。目前认为 ,上皮细胞永生化呈多阶段 ,即上皮细胞增殖———逃避老化期 (Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ)———逃避危机期 (Ｃｒｉｓｉｓ)———进入永生化 (Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ) ,其中 ,逃避Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ可能是上皮细胞永生化的最初阶段。方法 :借助ＥＢ病毒和ＴＰＡ的体外…