联合利用嵌套缺失和酚筛选法构建和鉴定目的基因的缺失突变体

目的 介绍一种快捷、无突变的目的基因缺失体构建和鉴定方法.方法 用Mlu I 和 Sac I酶将GCLC/pGL3在GCLC基因与pGL3连接处切开,形成以GCLC端为3'凹端而pGL3载体端为3'凸端的线型载体.利用外切核酸酶Ⅲ从GCLC基因端(3'凹端)单向逐一切除GCLC基因上的核苷酸,并在不同的时间终止其反应以获得一系列的GCLC基因缺失体.将GCLC基因缺失体与pGL3载体自身环化构建成GCLC基因序列缺失体的pGL3报道载体.最后用酚抽提和凝胶电泳法粗略挑选出不同长度的GCLC/pGL3缺失突变体.结果 利用嵌套缺失法构建出各种长度的GCLC基因的缺失突变体,且不存在基因突变的现象.利用酚筛选法快速鉴定出29种不同长度的缺失突变体.结论 联合利用嵌套缺失和酚筛选法可以高保真而快速地构建和鉴定目的基因的缺失突变体.     

大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因5′端调控序列初步分析

目的　分析大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位 (GCLC)基因 5′端调控区域和相应转录因子的特性。方法　克隆 1 760bp大鼠GCLC上游调控基因并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),利用外切核酸酶Ⅲ将大鼠GCLC基因的 5′端序列单向切成不同长度的缺失体,将所构建的GCLC-Luc及其 11个缺失体转染大鼠肺泡上皮细胞,通过测量转染后细胞的荧光素酶活性确定该基因的调控区域,并通过转录因子分析软件分析出可能与这些调控区域结合的转录因子,最后通过电泳迁移率改变实验 (EMSA)以明确该调控区的顺式元件和转录因子。结果　实验成功地克隆出大鼠GCLC上游调控基因及其报道载体GCLC-Luc及GCLC-Luc的 11个缺失体。将GCLC-Luc及其缺失体转染肺泡上皮细胞并分析荧光素酶活性:GCLC Luc(-1 758 /+2 Luc),缺失体 1(-1 231 /+2 Luc),缺失体 2(-1 108 /+2 Luc),缺失体 3(-1 087 /+2 Luc),缺失体 4(-876 /+2 Luc),缺失体 5(-745 /+2 Luc),缺失体 6(-705 /+2 Luc),缺失体 8(-613 /+2 Luc),缺失体 9(-595 /+2 Luc),缺失体 10( -403 /+2 Luc)和缺失体 11( -111 /+2 Luc)的荧光素酶值分别为(90 012±2 445)、(77 652±840)、(149 927±4 915)、(71 588±1 108)、(99 283±2 612)、(75 443±1 438)、(28     

转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因转染至肝癌细胞．方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因，将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN—SEA重组质粒，再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞，用RT—PCR和ELISA法鉴定．结果从产SEA标准菌株ATCCl3565中提取并扩增出SEA基因全长片段；SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN，经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致；将pLXSN—SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402，经筛选获得稳定表达的抗性单克隆．RT—PCR扩增出约800bD的基因片段，经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平．结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体，将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL－7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白．     

巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因的原核表达比较

目的：探讨巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因hmGFP的生物学特性及应用的可能性。方法：构建了hmGFP的两个原核表达载体并进行诱导表达。结果：低温下hmGFP获得了功能性表达而发光。深入比较了重组巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因hmGFP在两个表达体系中的表达差异，其中pETTFRX-hmGFP的重组蛋白表达水平和可溶性均比pET21b—hmGFP高。结论：对pETTFRX—hmGFP的表达条件进行了优化，为下一步hmGFP成熟重组蛋白的纯化及其荧光波谱分析奠定了良好基础。     

人心肌肌钙蛋白I的原核表达及其兔抗体的制备

目的:构建人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,并制备兔抗hcTnI抗体。方法:以化学方法合成hcTnI基因并插入融合表达载体pET21a( )的多克隆位点,构建重组表达质粒pET21a( )hcTnI。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,筛选阳性重组子,经IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以表达的hcTnI蛋白免疫家兔,制备抗hcTnI的抗体并进行纯化及特性鉴定。结果:成功地合成hcTnI基因,测序证实序列正确后亚克隆于表达载体pET21a( )中,经PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,序列分析表明其中的插入序列与cTnI基因完全一致。在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为24000的目的蛋白,约占菌体总蛋白的28%,Westernblot分析显示,表达的hcTnI蛋白具有良好的免疫反应性。以纯化的hcTnI免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价为3×10-4,且具有良好的特异性。结论:成功地构建hcTnI基因的原核表达载体pET21a( )hcTnI,并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出兔抗hcTnI的抗体,且效价及特异性均较良好,为进一步建立酶联免疫吸附法检测hcTnI奠定了基础。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因的人工合成及高效表达

目的人工设计合成完整的人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)基因,克隆并在大肠杆菌中获得高效表达。方法根据大肠杆菌遗传密码的偏爱性,人工设计合成hcTnI基因,测序正确后通过DNA重组技术将其插入温控型表达载体pBV220,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α,构建cTnI基因的非融合表达菌hcTnI-pBV220/DH5α,热激后诱导非融合蛋白的表达,用单克隆抗体检测特异性hcTnI蛋白表达。结果序列分析表明克隆载体中的cTnI人工基因与设计相符,双酶切电泳结果证明表达载体构建成功,经SDS-PAGE证实重组蛋白的相对分子质量(Mr)约24000,凝胶密度扫描约占菌体总蛋白的25%,能与cTnI单克隆抗体特异性结合。结论成功获得cTnI人工基因,构建了cTnI基因原核表达载体并获得了高效表达,为制备高特异性的抗体及临床检测应用奠定了基础。     

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因调控的初步研究

目的 研究抗氧化基因--大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的功能区及其调控表达.方法 克隆1.76 kb大鼠γ-GCS基因的重链亚单位--GCLC基因的上游调控序列,并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc (GCLC/pGL-3).利用嵌顿缺失方法构建GCLC基因的缺失体,并将其表达载体转染大鼠肺泡上皮细胞,在细胞中分析该基因的调控区域.通过该方法初步发现GCLC基因的上游调控序列的-745～-705 bp属负性调控区域.利用EMSA和supershift证实大鼠肺泡上皮细胞GCLC基因负调控区域的E-box元件能与转录因子USF1/USF2特异性的结合.将USF的真核表达载体和逆转录病毒表达载体分别导入肺泡上皮细胞,观察GCLC基因的转录活性和GCLC蛋白的表达情况.结果 GCLC基因的-403～-111 bp和-705～-613 bp区段属正调控区域;-745～-705 bp属负调控区域.EMS和supershift证实上游刺激因子(USF)能与该负调控区域的E-box元件结合抑制GCLC基因的转录和表达.结论 发现GCLC基因其中2个正调控区域(-403～-111 bp与-705～-613 bp)和1个负调控区域(-745～-705 bp), 其中负调控区域-745～-705 bp上的 E-box元件通过与USF结合介导GCLC基因的负性表达调控.     

药用海洋生物功能基因组研究

在资金有限和技术相对落后的情况下,如何开展我国的功能基因组研究,尽快进行具有资源优势的海洋生物功能基因组研究无疑是我国基因组研究领域赶超国际的突破口之一。结合现代基因组学的研究进展和发展趋势,以及我国传统中医药学研究和应用的基础,本文从一个新视角提出了开展药用海洋生物功能基因组研究的策略。为促进我国中医药的现代化和海洋生物肽类活性物质的研究提供了一个全新的思路和方向。本刊开辟“药学前沿”栏目,选登优秀的前沿药学研究论文,目的是活跃交叉科学和边缘学科在中药研究领域的碰撞,促进中药研究的发展。     

SARS相关冠状病毒Spike蛋白定点诱变

目的分析确定SARS-CoV splke蛋白序列中对SARS—CoV的感染能力相关性较强的位点，并进行定点诱变。方法比对不同来源株SAPS-CoV的Spike蛋白的序列，计算其相应位点的突变墒值和突变几率，结合进一步的生物信息学分析，筛选出经预测可能影响spike蛋白与其受体结合进而导致SARS病毒对宿主细胞的膜融合侵染能力的7个位点，对各个位点用重叠延伸PCR法或直接PCR法进行人工定点诱变，获7个突变片段，之后将各片段亚克隆至克隆载体PSP72中。结果经PCR和测序确认各片段点突变成功，并正确插入克隆载体PSP72中。结论成功实施Spike蛋白的定点诱变，获得7个突变片段的重组子，这些突变体可为研究这些突变位点在Spike蛋白与受体结合中的意义，进而可为阐述spike蛋白的结构与功能的关系、揭示Spike蛋白变异与SARS病毒侵入（染）细胞能力的相关性提供坚实的实验基础。     

转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定

目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染至肝癌细胞.方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因,将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN-SEA重组质粒,再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞,用RT-PCR和ELISA法鉴定.结果从产SEA标准菌株ATCC13565中提取并扩增出SEA基因全长片段;SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN,经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致;将pLXSN-SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402,经筛选获得稳定表达的抗性单克隆.RT-PCR扩增出约800bp的基因片段,经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平.结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体,将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL-7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白.