内源性大麻素对缺氧缺糖视网膜神经节细胞损伤的保护作用

背景 急性视网膜缺血缺氧性损伤在眼科较为常见,如青光眼急性发作、视网膜中央动脉阻塞、缺血性视神经病变等,可引起视网膜的缺血缺氧损伤,并可致视网膜神经节细胞(RGCs)的死亡.内源性大麻素(CB)及其受体(CBR)参与中枢神经系统外伤、缺血、炎症及中毒等多种生理病理过程. 目的 探讨视网膜神经节细胞(RGCs)在缺氧缺糖损伤中内源性CB的作用及意义.方法 取6周龄正常C57BL/6J小鼠眼球,制备小鼠视网膜垂直冰冻切片,采用免疫荧光染色法检测和验证CB1R和CB2R在RGCs中的表达.10只C57 BL/6J新生鼠浸入75％乙醇消毒后取眼球,在冰上预冷的DMEM培养基中分离视网膜进行RGCs原代培养,采用免疫荧光技术检测培养细胞中RGCs标志物Brn3a的阳性表达并确定培养细胞中CB1R和CB2R的表达.将原代培养14 d的RGCs分为正常对照组和氧糖剥夺(OGD)组,分别用完整培养基+体积分数95％空气+体积分数5％ CO2和无糖培养基+体积分数95％ N2+4％ CO24+体积分数1％ O2条件下培养20 h.采用JC-1染色法检测细胞中线粒体结构变化和RGCs的形态变化.各组细胞分别给予1μmol/L CB1R拮抗剂SR141716A、1μmol/L CB2R拮抗剂SR144528以及5μmol/L、10 μmol/L CB1R和CB2R激活剂WIN 55212-2,采用MTT法比较各组RGCs存活率.结果 正常C57BL/6J小鼠视网膜全层均可见CBR的表达.正常对照组培养的RGCs大小均匀,多呈多角形,细胞间轴突细长并形成网络,细胞中Brn-3a表达阳性;OGD组培养的细胞皱缩或形成碎片,多数细胞轴突消失,Brn-3a表达荧光强度明显减弱.正常对照组RGCs中JC-1染色显示,线粒体的黄色荧光明显强于OGD组,表明OGD组线粒体膜电位明显下降.MTT法检测显示,正常对照组RGCs存活率为(100.00±13.87)％,明显高于OGD组的(89.52±18.16)％,差异均有统计学意义(q=8.065,P=0.008);SR141716A和SR144528作用后OGD组细胞存活率分别为(116.63 ±22.21)％和(112.61±19.02)％均明显高于同组的无药物处理细胞的存活率(89.52±18.16)％,差异均有统计学意义(q=29.780、17.391,均P＜0.01),而SR141716A和SR144528作用后正常对照组细胞存活率的变化差异均无统计学意义(均P＞0.05). 结论 细胞缺氧缺糖时上调CB在细胞中的表达和激活CB活性.在缺氧缺糖条件下,抑制细胞中CBR的激活过程对RGCs有保护作用.     

大麻素对人和小鼠视网膜神经节细胞GABA电流的调控差异

目的 比较人和小鼠视网膜内源性大麻素类受体1(cannabinoid receptor,CB1)的表达差异,观察大麻素受体激动剂WIN55212-2对不同种属视网膜神经节细胞GABA电流的调控作用.方法 采用冰冻切片免疫荧光染色,观察CB1受体在视网膜中的表达.制备视网膜薄片,行全细胞膜片钳记录.在神经节细胞上给予100 μmol/L GABA快速加药诱导出电流I GABA,而后观察孵育大麻素受体激动剂WIN55212-2时GABA诱导的IGABA及同时孵育WIN 55212-2和大麻素受体拮抗剂SR141716A的电流IGABA.结果 人和小鼠视网膜CB1受体的分布有所不同,人的内核层、外核层、神经节细胞层有显著的CB1表达,但小鼠CB1受体主要表达在内网状层、外网状层上;膜片钳结果显示不管是在人还是在小鼠的视网膜上,孵育WIN55212-2后的GABA诱导电流幅度均有显著减小.不同的是,在人视网膜神经节细胞上,WIN55212-2明显减慢了GABA电流的反应速度,表现在电流达峰时间明显延长,恢复时间缩短(P＜0.05).WIN55212-2对小鼠视网膜神经节细胞GABA的反应速度无明显差别(P＞0.05).结论 CB1受体在人和小鼠视网膜中有差异性分布,对神经节细胞的GABA电流影响也不同.孵育WIN55212-2可抑制人和小鼠神经节细胞GABA电流幅度,但仅对人的神经节细胞的GABA电流的动力学速度有影响.     

全细胞膜片钳结合单细胞RT-PCR技术在NMDA诱导的小鼠青光眼模型视网膜双极细胞G蛋白通路研究中的应用

目的：介绍一种视网膜全细胞膜片钳联合单细胞逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术在视网膜单细胞信号成分分析中的应用,并研究N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）对ON型双极细胞中G蛋白相关mRNA表达的影响。方法：实验研究。3～5 周龄C57BL/6J小鼠20 只随机分为2 组,每组各10 只,分别玻璃体腔注射3 μl NMDA（30 nmol/L）构建青光眼模型,3 μl PBS（10 nmol/L）作为对照组,24 h后取视网膜,膜片钳下钳取单个ON型双极细胞,并做RT-PCR观察几种目的mRNA的表达差异。 2组间各参数比较采用Mann-Whitney检验。结果：RT-PCR结果显示蛋白激酶Cα亚基（PKCα）、瞬时感受电位离子通道1（TRPM1）、G蛋白α亚单位（Gαo）的表达在NMDA青光眼模型构建后分别为0.536 ±0.339、0.337 ± 0.271、4.36 ± 1.83,构建前后差异有统计学意义（U=0,P=0.001;U=0,P=0.002;U=36,P=0.002）。结论：NMDA诱导的青光眼模型可影响视网膜ON型双极细胞G蛋白耦联通道的信号传导。     

人和小鼠视网膜双极细胞的形态及功能比较

目的比较人和小鼠视网膜视杆双极细胞形态和药物模拟对光反应的电流特性。方法实验研究。对视网膜冰冻切片行免疫荧光染色,用PKC-α抗体标记视网膜视杆双极细胞,以观察其形态分布特点。在灌流充氧的情况下制备视网膜薄片切片,行视网膜ON型以及OFF型双极细胞的全细胞膜片钳记录。分别在ON型双极细胞和OFF型双极细胞上给予快速加药40 µmol/L LY3414925或100 µmol/L AMPA,诱导出谷氨酸电流,以记录双极细胞模拟对光反应,并比较人和小鼠的谷氨酸电流动力学的差异,人和小鼠各项数据比较采用非参数检验（Mann-Whitney检验）进行处理。结果人和小鼠的视网膜视杆双极细胞形态分布相似,但PKC-α表达略有不同。膜片钳结果显示人视网膜ON型双极细胞的模拟对光反应的上升相的达峰时间为（1.91±0.11）ms,与小鼠视网膜ON型双极细胞[（0.83±0.08）ms]相比明显较长（U=0.00,P＜0.01）,而人视网膜ON型双极细胞的模拟对光反应恢复时间为（1.34±0.40）ms,明显短于小鼠[（20.06±3.07）ms]（U=0.00,P＜0.01）。但人和小鼠视网膜OFF型双极细胞电流动力学即电流幅度[人：（143.0±2.1）pA;小鼠：（136.3±2.2）pA]、反应上升时间[人：（1.91±0.35）ms;小鼠：（1.28±0.52）ms]和恢复时间[人：（220.5±10.8）ms;小鼠：（168.1±29.3）ms]差异均无统计学意义。结论 视杆双极细胞在人和小鼠视网膜中分布位置和形态大致相似。人和小鼠视网膜ON型双极细胞电流特性有差异。