过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的腺病毒构建

目的设计特异性标记过氧化物酶体的绿色荧光蛋白，构建腺病毒载体，并感染培养的大鼠心肌细胞H9C2，检测该腺病毒载体的表达效率，通过共聚焦显微镜观察细胞过氧化物酶体的分布，同时给予细胞缺氧处理，对比细胞内过氧化物酶体的变化。方法（1）设计带有过氧化物酶体信号肽序列的绿色荧光蛋白序列。（2）PCR扩增该序列片断，并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack中；pAdTrack经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组。重组绿色荧光蛋白质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后，转染293A细胞，进行病毒包装，得到Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒。（3）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒和不带有信号肽序列的Ad-GFP腺病毒感染培养的H9C2，24h后共聚焦显微镜下观察。（4）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染H9C2细胞后，分为正常培养和1%氧浓度培养两组，24h后观察。结果重组Ad-GFP-Peroxi腺病毒载体构建成功；与Ad-GFP腺病毒相比，Ad-GFP-Peroxi腺病毒能够特异性显示大鼠心肌细胞内过氧化物酶体的分布；且缺氧刺激后H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象。结论利用同源重组的方法成功构建的过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的过表达腺病毒，对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率，共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况，且缺氧刺激导致过氧化物酶体分布聚集。