侵入细胞内的牙龈卟啉单胞菌影响人牙周膜细胞的增殖及成骨分化

目的探究活体牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）侵入人牙周膜细胞（HPDLCs）后,对细胞增殖性能及成骨向分化作用的影 响。方法将P. gingivalis与HPDLCs以感染复数（MOI）为10、100共培养90 min、8、24 h后,利用细胞侵袭实验比较不同时间及 MOI值下,P. gingivalis对HPDLCs的侵袭效能。用CFDA-SE（Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester, C29H19NO11） 标记HPDLCs,加入P. gingivalis后共培养8、24、48、72 h,流式细胞仪检测细胞增殖性能的变化。将SYTO9标记的P. gingivalis 与HPDLCs共培养24 h后,流式细胞荧光分选技术（Fluorescence activated Cell Sorting, FACS）分选出被感染细胞,利用实时荧 光定量PCR对Runx2基因进行检测,并且对分选出的细胞进行矿化诱导,分别于7、14、21 d,进行茜素红染色检测HPDLCs矿化 结节形成。结果P. gingivalis 与HPDLCs 共培养90 min 后,即可进入细胞内,共培养24 h 后,侵袭效能达到最大值。被P. gingivalis感染后,细胞的Runx2基因表达明显下调,且其矿化结节的形成明显低于对照组。结论侵袭进入HPDLCs内的活体 P. gingivalis,未对细胞的增殖产生明显的影响,但可以明显抑制细胞的成骨分化作用,这可能是通过下调Runx2 的表达来实 现的。     

新型抗菌肽KR-1的设计、筛选及抗菌活性评价

目的 构建高活性、低毒性的新型抗菌肽,对其抗变异链球菌及其他口腔致病菌的活性进行评价,探讨其在防治龋病中的潜在应用价值。方法 以天然抗菌肽Histatins5的类似物Dhvar4为模版合成新型抗菌肽KR-1、KR-2。通过所设计抗菌肽对变异链球菌的最小抑菌浓度（MIC）实验,兔血红细胞溶血试验以及CCK-8法,筛选出高活性、低毒性的目标抗菌肽;使用96孔板培养变异链球菌生物膜,分为实验组（用浓度梯度为0.6×、0.8×、1×、2×MICs的KR-1进行处理）与阳性对照组（用浓度梯度为0.6×、0.8×、1×、2×MICs的洗必泰进行处理）,通过结晶紫染色定量法观察生物膜量的改变;使用10×MIC浓度KR-1作用于变异链球菌生物膜后通过激光共聚焦显微镜观察结构的改变;通过KR-1作用口腔链球菌后杀菌所需的时间探讨目标抗菌肽对口腔链球菌的抗菌效率。结果 实验测得KR-1及KR-2的MIC分别为3.2 μmol/L和12.8 μmol/L,有效浓度下,兔血红细胞溶血率分别为0.35%和48.8%,24 h牙龈成纤维细胞存活率分别为72.96 %和21.94 %,将活性较高、生物相容性较好的KR-1作为目标抗菌肽;经结晶紫染色后测定KR-1的50%生物膜最小抑制浓度（MBIC50）低于1.92 μmol/L,且浓度为2.56 μmol/L时效果优于阳性对照组洗必泰（P=0.001）,共聚焦显微镜下观察可见经KR-1处理后生物膜结构疏松;KR-1在5 min内可杀灭约90%细菌。结论 KR-1抗菌肽具有较强的抗菌活性和较低的毒性,且有良好的抗变异链球菌生物膜作用。