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目的 大规模发酵、纯化幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB)基因疫苗,并对纯化后的疫苗进行鉴定。方法 大规模发酵DH5α(pT-ureB),收获的细菌经碱裂解后,用两步离子交换层析方法分离、纯化疫苗,通过紫外分光光度计、酶切、体外转染等对疫苗进行鉴定。结果 发酵幽门螺杆菌ureB核酸疫苗,并经离子交换层析方法纯化获得了高质量的疫苗。结论 纯化的ureBDNA疫苗为进一步的免疫实验奠定了基础。 相似文献
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幽门螺杆菌沙鼠感染模型的定量分析研究 总被引:3,自引:2,他引:1
目的 建立幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)蒙古沙鼠感染模型 ,并通过比较定量培养、快速脲酶试验和ELISA三种方法 ,确定Hp动物模型的最佳评判指标。方法 采用临床分离的Hp强毒株对 2 0只蒙古沙鼠进行感染 ,4周后剖杀。取血按常规ELISA法检测抗Hp抗体 ;分别剪取胃窦、胃体和胃底粘膜组织作定量培养 ;其余组织作快速脲酶试验及病理检查。结果 经定量培养结果显示沙鼠的Hp感染率达到 80 % (16/ 2 0 ) ,胃窦、胃体和胃底的Hp定植密度的对数均值分别为 5 2 4± 1 5 0、4 11± 3 2 2、和0 97± 2 3 9;16只Hp阳性沙鼠中脲酶试验有 4只阳性 ,ELISA有 7只阳性 ,阳性鼠的感染均值显著高于阴性鼠。结论 经筛选的Hp强毒株成功感染沙鼠后 4周 ,Hp主要定植于胃窦和胃体部 ;定量培养仍是评价Hp动物模型的最有效方法 相似文献
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幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒的构建及鉴定 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 克隆幽门螺杆菌hpaA基因,并构建其真核表达质粒。方法 以HpNCTC11637基因组DNA为模板, PCR扩增hpaA基因,亚克隆至pMD18 T载体中,目的基因经酶切纯化后插入pTCAE,转化E.coliDH5α,酶切并测序鉴定正 确的重组质粒命名为pT hpaA。电穿孔法将pT hpaA转染CHO细胞,Westernblot检测HpaA蛋白的表达。结果 克隆重组 得到pT hpaA,将pT hpaA电穿孔法转染CHO后,培养上清经Westernblot检测,在相对分子量为30000条带处出现特异性抗 原抗体反应。结论 成功构建了幽门螺杆菌hpaA真核表达质粒,体外CHO细胞转染和Westernblot实验证实了HpaA蛋 白的表达,为进一步的免疫实验奠定了基础。 相似文献
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目的大规模发酵、纯化幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB)基因疫苗,并对纯化后的疫苗进行鉴定。方法大规模发酵DH5α(pT ureB),收获的细菌经碱裂解后,用两步离子交换层析方法分离、纯化疫苗,通过紫外分光光度计、酶切、体外转染等对疫苗进行鉴定。结果发酵幽门螺杆菌ureB核酸疫苗,并经离子交换层析方法纯化获得了高质量的疫苗。结论纯化的ureBDNA疫苗为进一步的免疫实验奠定了基础。 相似文献
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肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espA基因的克隆与表达 总被引:4,自引:0,他引:4
目的 通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA蛋白,并分析其免疫学性质。方法 采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因,T/A法克隆,连接至pET-28a(+)载体上,转化宿主细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE测定其相对分子质量,同时分析其N端氨基酸序列,免疫家兔鉴定其抗原性。结果 重组espA基因片段的测序结果与GenBank上基因序列只有1个碱基不同,一致性为99.83%,所编码的氨基酸序列没有改变。重组EspA蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约30%。免疫家兔所得抗体滴度为1:32。结论构建高效表达EspA蛋白的重组载体pET-28a(+)-espA,表达的蛋白具有良好的免疫原性,为进一步制备亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
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目的研究重组幽门螺杆菌疫苗口服免疫BALB/c小鼠后免疫保护效果和维持时间,并初步探讨其免疫机制。方法ELISA检测特异性抗体水平;同时ELISPOT检测派伊尔结特异性抗体分泌细胞;RT-PCR显示T淋巴细胞IFN-γ、IL-4 mRNA表达差异;以培养、组织切片、尿素酶试验结果判断攻毒保护率。结果(1)疫苗组在胃、肠、气管冲洗液和血清产生高水平抗体;(2)疫苗组小鼠派伊尔结特异性抗体分泌细胞显著升高(P=0);(3)抗原刺激后,免疫组T淋巴细胞的IFN-γ、IL-4 mRNA表达量升高;(4)免疫组攻毒保护率为86.7%-92.8%,且至少维持30周。结论重组幽门螺杆菌疫苗口服免疫小鼠后有良好的预防Hp感染作用;疫苗诱导的可能是TH1/TH2型免疫应答。 相似文献
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重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法 应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果 PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论 所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。 相似文献
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目的观察并比较携带Hp不同抗原基因的质粒pTCAE-ureB(pT-ureB)和pTCAE-hpaA(pT-hpaA)肌注小鼠后诱导的体液免疫应答。方法构建真核表达质粒pT-ureB;与已成功构建的质粒pT-hpaA分别作为疫苗方案,肌肉注射免疫BALB/c小鼠并设置空质粒对照,末次免疫后第2、4、6周分别用间接ELISA法检测小鼠血清特异性IgG抗体滴度。结果两免疫组在末次免疫后第2周均可出现特异性IgG,抗体滴度随时间逐渐增高;末次免疫后第6周,两免疫组的抗体滴度与对照组相比较,差异极显著(P<0.01);且pT-ureB免疫组抗体滴度显著高于pT-hpaA(P<0.01)。结论pT-ureB具有良好的免疫原性,诱导体液免疫应答的能力优于pT-hpaA。 相似文献
10.
目的构建表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。方法全基因合成pCDR1两条核苷酸链,在C端加上6-His标签,退火互补后插入原核表达载体pYA3149中,构建重组质粒pR1,将该重组质粒转入鼠沙门菌终宿主菌株X4550,获得杂合菌株X4550(pR1)。体外诱导表达后斑点印迹鉴定表位肽的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。体外诱导后6h细菌裂解上清液中,检测到表位肽的表达,该蛋白能与鼠抗His单克隆抗体特异结合。重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。结论成功构建了能稳定表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。 相似文献