功能未知基因C17orf77重组蛋白及多克隆抗体的制备

目的体外克隆表达C17orf77重组蛋白,制备其多克隆抗体,初步探索该蛋白的生物学作用,观察其细胞系分布特征。方法以HepG2细胞cDNA为模板,PCR扩增C17orf77目的基因片段,构建pET-32a(+)-C17orf77原核表达载体。转化大肠埃希菌,IPTG诱导C17orf77重组蛋白表达并进行Western blot鉴定。以重组蛋白免疫大耳白兔,获得兔抗C17orf77蛋白多克隆抗体,并分析其特异性及检测效价。MTT法观察不同浓度重组蛋白对HepG2细胞增殖的影响。利用Western blot观察C17orf77蛋白在HepG2、L02、LX2和Jurkat细胞系的表达情况。结果 PCR扩增获得C17orf77基因片段,成功诱导表达了C17orf77重组蛋白。制备了多克隆抗-C17orf77,ELISA检测抗体效价1∶1280000。不同浓度C17orf77重组蛋白对HepG2细胞无明显增殖促进或抑制活性(P0.05)。C17orf77蛋白在HepG2、L02、LX2和Jurkat细胞系均有分布。结论利用体外克隆表达的C17orf77重组蛋白可制备效价和特异性均较高的多克隆抗体。HBV感染相关基因C17orf77在体外肝脏的间质和实质细胞,以及CD4+T细胞系(Jurkat细胞)均有不同程度的表达。提示该基因可能与HBV感染的致病过程相关。     

N-糖基化修饰蛋白gp73与肝硬化患者Child-Pugh的关系

目的评价N-糖基化修饰蛋白gp73的血清水平与肝硬化患者Child-Pugh之间的关系及其可能的临床意义。方法所观察的患者均为2009年1月~2010年10月在北京地坛医院门诊及住院肝硬化患者,所有患者均为HBsAg阳性。观察患者共610例,其中男性患者448例,年龄17~82岁,平均48岁;女性患者162例,年龄18~76岁,平均55岁。入组肝硬化患者的Child-Pugh分级主要依据血清白蛋白、总胆红素、凝血酶原活动度、腹水及肝性脑病评价等5项指标。血清gp73浓度采用ELISA法检测。结果伴随肝功能衰退,血清gp73水平也相应升高。血清gp73水平Child-Pugh为C级的患者（255.78 ng/mL±100.89 ng/mL）显著高于B级（203.30 ng/mL±99.15 ng/mL）和A级的患者（125.28 ng/mL±67.05 ng/mL）。血清gp73与白蛋白之间呈显著负相关（r=-0.52,P〈0.0001）。结论 HBV感染肝硬化患者血清gp73水平随肝功能恶化而升高。     

抗病毒治疗对失代偿期乙肝肝硬化患者预后的影响

目的观察抗病毒治疗对失代偿肝硬化患者生存时间及肝癌发生的影响。方法回顾性分析1998年1月~2009年12月,于北京地坛医院住院至少3次或3次以上的HBV感染相关的失代偿肝硬化患者,抗病毒治疗对其预后的影响。所有分析对象是在最后1次住院期间死亡的患者。其中男168例,女69例。237例患者中70例患者接受了连续6个月以上的抗病毒治疗。耐药检测采用PCR法扩增病毒聚合酶相应的基因片段,并进行测序分析。结果接受核苷类似物抗病毒治疗的70例患者生存时间（34.44±28.39）个月,显著长于未接受治疗的患者（27.12±24.29）个月。167例未接受抗病毒治疗的失代偿肝硬化患者中,最终60例死亡前被确诊为肝癌,发生率为35.93%（60/167）;而接受抗病毒治疗的70例患者中,20例死亡前被确诊为肝癌,肝癌发生率为28.57%（20/70）。两组比较无显著性差异（P=0.37）。治疗期间6例患者出现耐药,但未出现病情加重。结论核苷类似物对HBV感染失代偿肝硬化患者的治疗有助于延长患者的生存期,但不能降低肝癌的发生。     

GLT25D1血清水平与慢性乙型肝炎肝纤维化进程相关性分析

目的 探讨GLT25D1血清水平与慢性乙型肝炎肝纤维化进程的相关性.方法 通过抗原表位预测软件BepiPred 1.0Server将GLT25D1基因片段分为GLT25D 1-1和GLT25D 1-2两部分,PCR扩增获得目的片段,构建其原核表达质粒；对制备的多克隆抗体进行效价及特异性分析.通过以GLT25D1为抗原的ELISA双抗体夹心的方法,检测其在HBV感染不同阶段的患者的血清水平.结果 成功表达重组蛋白,Western blot鉴定正确；成功制备兔抗人(GLT25D1-1、GLT25D 1-2)的多克隆抗体,效价较高,特异性良好.通过ELISA方法检测HBV感染患者血清,慢性乙肝(病理结果不超过S3期)、肝硬化(S3-4期及S4期)以及肝癌患者中GLT25D1的OD值较正常组均有显著性差异(P＜0.01).结论 通过血清学检测结果,我们发现GTL25D1存在于HBV感染的肝病的各进程中,进而我们推测血清GLT25D1可能会作为检测肝纤维化进程的一个新的血清学指标.     

抑制O-糖基化修饰促进乙型肝炎病毒的释放

目的：探讨抑制O-糖基化修饰对乙型肝炎病毒颗粒组装的影响。方法采用O-糖基化修饰抑制剂Benzyl-α-GalNAc干预HepG2.2.15细胞。经7-AAD染色,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。采用实时荧光定量PCR方法检测上清HBV病毒载量。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清乙型肝炎病毒大蛋白（the hepatitis B virus large surface protein,HBV LHBs）水平。采用蛋白免疫印迹（Western blot）方法检测细胞中LHBs蛋白含量。结果 Benzyl-α-GalNAc能显著促进细胞凋亡,上清中HBV DNA和LHBs水平呈剂量依赖性增加;Benzyl-α-GalNAc抑制细胞中LHBs蛋白表达。结论抑制细胞O-糖基化修饰促进细胞凋亡,从而释放HBV LHBs和病毒颗粒;但在某种程度上抑制细胞O-糖基化修饰能够抑制细胞内LHBs合成。     

FAM172A及其异构体重组蛋白对体外培养肝细胞增殖的影响

目的体外克隆人类基因FAM172A,构建其原核表达载体并诱导其重组蛋白的表达,制备兔抗FAM172A重组蛋白的多克隆抗体,观察其在不同细胞系的表达情况。观察FAM172A-1和FAM172A-3蛋白对L02细胞增殖的影响。方法利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）及PCR技术,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-FAM172A-1和pET-32a（＋）-FAM172A-3。诱导该基因不同异构体重组蛋白的表达,并通过蛋白质免疫印迹（Western blot）技术进行鉴定。纯化后的重组蛋白FAM172A-1和FAM172A-3与肝细胞L02细胞共孵育,观察不同浓度的重组蛋白对细胞增殖的影响。利用纯化后的FAM172A（异构体3）重组蛋白免疫大耳白兔,获得抗FAM172A-3蛋白的多克隆抗体,利用酶联免疫吸附法（ELISA）以及Western blot技术对获得的多克隆抗体进行效价分析及特异性检测。结果成功扩增获得FAM172A（异构体1、3）的基因片段,测序结果与GenBank已公开的基因序列一致;成功表达FAM172A（异构体1、3）的重组蛋白,经过Western blot鉴定正确;纯化后的重组蛋白FAM172A （异构体1、3）与L02细胞共孵育结果发现,两者对L02细胞在一定浓度范围内均有促进细胞增殖的作用。所制备的兔抗人FAM172A-3重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测显示其效价可达1︰1280000, Western blot检测证实该多克隆抗体的特异性良好;Western blot分析显示,该蛋白在肝脏间质细胞和实质细胞均有一定程度的表达。结论 FAM172A蛋白在肝实质细胞及肝间质细胞均表达,且其重组蛋白可以促进L02细胞增殖,推测该基因可能与肝细胞损伤、肝纤维化以及肝细胞再生等发生机制有关。     

功能未知基因C16orf68在不同肝细胞系内的表达特征

目的获取人基因C16orf68,构建原核表达载体,诱导重组蛋白的表达,制备兔抗C16orf68蛋白多克隆抗体,观察C16orf68在各细胞系的表达特征。方法用RT-PCR技术,从肝星状细胞系LX2的总RNA中获得编码C16orf68基因功能片段的cDNA,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-C16orf68,并导入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达重组的重组蛋白。利用Western blot技术、生物质谱技术对表达的C16orf68进行确认。利用纯化的C16orf68重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗C16orf68蛋白的多克隆抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。利用Western blot技术观察C16orf68在多个细胞系的表达特征。结果扩增获得C16orf68基因片段,测序结果与GenBank已公开的基因序列相一致,成功表达了C16orf68重组蛋白,经Western blot鉴定、生物质谱Q-TOF分析均显示表达正确。利用纯化后的重组蛋白,制备了兔抗人C16orf68多克隆抗体,酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价〉1：320 000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好,Western blot结果显示各细胞系该蛋白主要表达于肝实质细胞。结论 C16orf68在肝脏主要表达于肝实质细胞,可能与肝细胞损伤相关。     

糖蛋白C6ORF120在CD4+T淋巴细胞凋亡中的作用研究

背景: 在HIV感染过程中,尽管CD4+T凋亡和CD8+T细胞反应已经进行了广泛的研究,但HIV感染过程中CD4+T细胞凋亡信号究竟是如何启动的,至今尚未被阐述。本研究的目的在于探讨人类功能未知基因C6orf120的功能,阐述其在衣霉素细胞诱导CD4+T细胞凋亡中的可能作用。 方法：从HIV感染者外周血单核细胞（PBMCs）中克隆C6orf120编码序列。将获得的DNA片段插入到pET-32a表达系统中,转化大肠杆菌E.coli,制备C6ORF120重组蛋白。采用磁珠分离法制备原代CD4+T和CD8+T细胞。原代T细胞在1 × 106 细胞/毫升条件下培养,并与0, 0.1, 1, 10, 100, 以及 200 ng/mL 的C6orf120重组蛋白共孵育48小时,然后收获细胞并进行细胞周期和凋亡分析。采用衣霉素诱导Jurkat细胞凋亡。采用内质网应激标志物GRp78和GADD对内质网应激进行评价。 结果: 本研究制备了C6ORF120重组蛋白及其多克隆抗体。免疫组织化学分析显示C6orf120主要表达与肝细胞和淋巴结生发中心的细胞。在0.1, 1, 10, 100, 以及 200 ng/mL浓度下,C6ORF120重组蛋白可以诱导CD4+T细胞凋亡,并增加Jurkat细胞的G2期。Western blot分析显示C6ORF120重组蛋白体外可以增加Jurkat细胞GRp78和GADD的表达。 结论: 研究结果提示,C6ORF120可以诱导CD4+T淋巴细胞的凋亡,其机制至少部分是通过诱导内质网应激实现的。     

北京地区干扰素联合利巴韦林经治与未经治慢性丙型肝炎患者直接抗病毒药物的天然耐药突变分析

目的探索我国北京地区慢性丙型肝炎(CHC)患者直接抗病毒药物(DAA)的天然耐药突变发生情况,比较干扰素(IFN)联合利巴韦林(RBV)经治与未经治患者DAA的天然耐药突变。方法收集2009年7月~(-2)013年11月于北京大学第一医院就诊的101例基因1b型CHC患者,其中IFN联合RBV经治患者40例,未经治患者61例。提取患者的HCV RNA,PCR法扩增并测序HCV NS3、NS5A、NS5B区基因,进行序列比对和耐药分析,并比较天然耐药发生率。符合正态分布的计量资料组间比较采用t检验,非正态分布的计量资料组间差异比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料组间比较采用χ~2检验或Fisher精确概率法。结果共获得84例(83.17%)NS3区、92例(91.09%)NS5A区和97例(96.04%)NS5B区基因序列信息。NS3区7例(8.33%)存在DAA天然耐药突变(T54S,n=1,1.19%;R117H,n=5,5.95%;N174F,n=1,1.19%)。NS5A区19例(20.65%)存在天然耐药突变(L28M,n=7,7.61%;L31M,n=1,1.09%;P58S,n=4,4.35%;Y93H,n=7,7.61%)。NS5B区95例(97.94%)存在天然耐药突变(L159F,n=1,1.03%;C316N,n=92,94.85%;A421V,n=6,6.18%;R422K,n=1,1.03%;M426L,n=3,3.09%;V499A,n=38,39.18%)。NS3、NS5A和NS5B区天然DAA耐药突变发生率在IFN联合RBV经治与未经治患者之间差异均无统计学意义(P值均0.05)。结论未接受过DAA治疗的我国北京地区基因1b型CHC患者中存在DAA天然耐药突变,这些突变大多为低度耐药突变,其对DAA临床疗效的影响仍需进一步研究。未观察到既往IFN联合RBV治疗对CHC患者DAA天然耐药突变率的影响。     

2012年AASLD肝硬化腹水诊疗指南之肝肾综合征诊疗内容解读

美国肝病研究学会（the American Association for the Study of Liver Diseases,AASLD）于2013年2月在Hepatology上发布了2012年肝硬化腹水诊疗指南的更新,与2009年AASLD指南关于肝肾综合征（HRS）的诊疗内容比较,有以下3方面的更新：（1）治疗：新的指南中,缩血管药物例如特利加压素取代了传统治疗药物多巴胺,成为HRS新的治疗热点;（2）预防：明确HRS预防的重要性,需防治结合;（3）诊断：新的生物标记物（尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白,uNGAL）的使用,可以协助肝肾综合征诊断.