两家系强直性肌营养不良三核苷酸重复数检测与临床研究

我们对2例强直性肌营养不良症(ＤＭ)患者及家系成员的ＣＴＧ(胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘧啶)重复数检测,与临床表现、电生理检查作比较研究。现报道如下。资　　料临床资料　2例ＤＭ患者,按实用神经病学拟定的标准确诊[1]。对2例患者及家系25名成员进行详细的内科、眼科及神经系统检查,神经电生理检查肌强直电位、ＭＣＶ、ＳＣＶ、ＶＥＰ和心电图观察。两家系为非近亲婚姻、上海籍。家系2中12名检出4名患病者。家系1中13名成员临床检查皆正常。ＣＴＧ重复数测定　对两名患者及家系成员、1名正常对照者,分别抽出10ｍＬ静脉血置于肝素抗凝管摇匀。…     

国内110株新生隐球菌临床株变种、基因型和交配型分析

目的 对国内部分地区的新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)临床株进行分子流行病学调查,分析其变种、基因型和交配型的构成和分布.方法 (1)PCR指纹分型法:以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物对模板进行PCR扩增,将所有受试菌株鉴定到8种主要基因型水平.(2)利用变种和交配型特异性引物扩增分型法,区分格鲁比变种(C.neoformans var.grubii)、新生变种(C.neoformans var.neoformans)和格特变种(C.neoformans var.gattii),同时鉴定α和a交配型.结果 110株临床株中,98株(89.1%)为格鲁比变种,均为VNI基因型和α交配型;9株(8.2%)格特变种,包括VGⅠ基因型、α交配型8株(7.3%)和VGⅡ基因型、α交配型1株(0.9%);2株(1.8%)为AD杂合体,VNⅢ基因型,-/α和α/-交配型各1株;1株(0.9%)为新生变种,VNⅣ基因型和a交配型.结论 我国新生隐球菌临床株包含3个变种和AD杂合体.与国外情况比较,相似的是国内临床株中绝大部分为α交配型菌株,且格鲁比变种中的VNⅠ基因型占了其中的大部分;但未发现VNⅡ、VGⅢ和VGⅣ基因型菌株.     

散发性帕金森病患者γ-synuclein基因的研究

目的 探讨γ-synuclein基因C243G和A377T多态在散发性帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的疾病易感性中的意义。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态法，对上海汉族人中145例PD患者和184名正常人进行γ-synuclein基因C243G和A377T多态分型，并作与PD的遗传关联研究。结果 PD患者与正常对照间γ-synuclein基因C243G和A377T多态分布的差异无显著性，两种多态与PD亦无关联(P值均大于0．05)。结论 上海地区汉族人群中γ-synuclein基因C243G和A377T多态与散发性PD无关。     

恶性疟原虫113肽抗原基因重组的减毒鼠伤寒沙门菌在家兔中免疫应答的研究

我们已经在减毒鼠伤寒沙门菌ＳＬ３２６１以融合蛋白的形式表达了人工合成的恶性疟原虫杂合１１３肽基因ＡＢ（ＧＺ－ＡＢ）。活菌以２×１０９ＣＦＵ经口服免疫新西兰家兔，用ＥＬＩＳＡ测定抗体水平，结果于首次免疫或加强免疫后都可检测到一定水平的特异性抗体。所免疫的家免可以诱发针对恶性疟原虫抗原及ＧＺ－ＡＢ的迟发性超敏反应（ＤＴＨ）。我们的研究表明，含有多个恶性疟原虫抗原表位的人工合成基因可以在减毒鼠伤寒沙门菌中表达，活菌可诱发家兔产生特异的体液免疫及细胞免疫，为恶性疟口服活菌苗的制备打下基础。     

恶性疟原虫抗原基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及免疫原性的初步鉴定

将人工合成的恶性疟原虫杂合７４肽抗原基因克隆到表达载体ｐＷＲ４５０－１中，获得了重组质粒ｐＷＲＣ，将其先转化到减毒伤寒沙门氏菌ＬＢ５０００修饰后，再转化到ＳＬ３２６１，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲＣ）。ｐＷＲＣ在ＳＬ３２６１中以β－半乳糖苷酶－杂合多肽抗原Ｃ融合蛋白（ＧＺ－Ｃ）形式表达，表达量约占菌体蛋白总量的１１．３％．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及免疫双扩散显示ＧＺ－Ｃ可与兔抗ＧＺ－Ｃ抗原的免疫血清发生特异反应。ＧＺ－Ｃ识别兔抗ＧＺ－Ｃ及鼠抗恶性疟原虫抗血清的ＥＬＩＳＡ滴度分别为１：３２００及１：５１２０。初步结果表明ＳＬ３２６１（ｐＷＲＣ）表达的ＧＺ－Ｃ具有抗原性。连续传代ＳＬ３２６１（ｐＷＲＣ）未见质粒ｐＷＲＣ丢失及对宿主有明显的毒性。     

CTLA-4单核苷酸多态性与中国汉族人类风湿关节炎的关联分析

目的在中国汉族类风湿关节炎（RA）患者中，检测细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）基因中的单核苷酸多态性（SNPs）并进行关联分析。方法用变性梯度凝胶电泳法（DGGE）在326例RA患者和250名健康志愿者提供的血样中检测CTLA-4基因的SNPs（MH30，＋49，CT60和J031）．分析单个位点的等位基因和基因型频率是否与RA相关。结果在RA患者中，CTLA-4的＋49和CT60的等位基因频率及它们的基因型频率显著高于健康对照组（P=0.028和0．007）；此两种SNPs构成的4种单倍体的分布状态两组间差异有统计学意义（x^2=10．58，d．f=3，P=-0．014）。结论CTLA-4基因上2个SNPs及单倍体型与中国汉族RA之间存在显著的相关性。     

白色念珠菌ERG11突变基因在毕氏酵母中的表达

目的 将含有点突变的白色念珠菌编码基因ERG11克隆至毕氏酵母中进行表达,判断其在白色念珠菌对氟康唑敏感性中的作用.方法 将含有点突变的白色念珠菌编码基因ERG11与pPIC3.5K载体重组,构建pPIC3.5K/Ca1.6k重组体,经Top10F'鉴定和筛选,电转入毕氏酵母GS115中,经过诱导表达出现目的 蛋白后,进行药物敏感性试验,确定点突变与耐药的关系.结果 含Y132H突变转化菌株和含Q474K突变的转化菌株对氟康唑的MIC分别上升16倍和8倍,证实其突变与耐药有关.结论 氟康唑耐药可发生于白色念珠菌编码基因ERG11的Y132H与Q474K点突变中.     

不同龋敏感儿童牙菌斑内口腔链球菌的PCR-DGGE分析

目的 应用PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术,分析不同龋敏感儿童牙菌斑内口腔链球菌菌群及其菌种组成的多样性.方法 牙菌斑组织取自45例学龄前儿童,根据乳牙龋失补牙面(dmfs)指数分为无龋(dmfs=0)、中龋(dmfs=4～6)和高龋(dmfs＞8)(n=15).分别提取细菌总DNA,进行链球菌属rnp B特征序列的PCR扩增及DGGE分析,克隆、测序并与核酸序列数据库的序列进行比对.结果 无龋儿童菌斑中口腔链球菌菌群的基因型分布均显著高于中龋和高龋儿童(P＜0.05);变异链球菌群是高龋组中的优势菌群.结论 PCR-DGGE技术结合rnp B基因克隆文库分析可较灵敏、直观地反映牙菌斑中链球菌属各菌群及其菌种的组成情况.     

含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌株的构建与鉴定

目的:构建含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261(减毒鼠伤寒沙门氏菌)疫苗菌.方法:将质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入LB5000(鼠伤寒沙门氏菌)进行甲基化,利用修饰后重组质粒转化终宿主菌SL3261,抗生素筛选后挑取单个菌落扩增进行抽提质粒和PCR鉴定,SL3261疫苗菌与HepG2细胞体外共培养,荧光显微镜和RT-PCR分别检测GFP(绿荧光蛋白)的表达和4-1BBL基因的转录.结果:导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261经抽提质粒电泳后获得了同原转化质粒相同大小的目的条带,质粒PCR获得了约930 bp的条带,200个HepG2细胞感染SL3261为201±46 CFU、SL3261-pIRES2-EGFP为163±37,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32,含质粒SL3261在体外感染HepG2细胞的能力同原细菌基本相同(P＞0.05).感染含质粒SL3261的HepG2细胞观察到GFP表达,感染含重组质粒SL3261的HepG2细胞经RT-PCR检测到约930 bp的目的条带.结论:成功构建了能携带大鼠4-1BBL基因真核表达质粒的SL3261疫苗菌.     

一种新的血管生成抑制因子-TSF的设计及表达

目的 选择PF4和TSP1的高活性片段设计融合基因－TSF，在大肠肝菌表达，细胞水平上检测表达产物的生物学活性。方法 PF4的C－末端13肽和TSP1的429－459片断31肽通过Gly-Pro-Gly肽桥设计为融合蛋白－TSF。采用pGEX-2T载体在E.coli JM109中表达TSF蛋白。采用MTT方法测定TSF及其相关性GST－TSF，PF4（58－70），TSP1（429－459）等对血管内皮细胞，平滑肌细胞，QGY7721人肝癌细胞，HLF人肺成纤维细胞等生长的抑制效应。结果 合成的TSF融合基因，克隆到pGEX-2T载体，转化E .coli JM109，获得了TSF蛋白的高效表达。建立了TSF蛋白的纯化复性方法，获得了GST－TSF融合蛋白及TSF蛋白。TSF，GST－TSF，PF4（58－70）和TSP1（429－59）均特异抑制血管内皮细胞的生长，其中TSF的活性最强，活性大小次序为TSF＞GST－TSF＞PF4（58－70）＞TSP1（429－459）。结论 融合表达蛋白－TSF在细胞水平上能高效特异抑制血管内皮细胞的生长。