含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2表达载体的构建

目的:骨形态发生蛋白2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一.实验拟构建绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(human Bone Morphogenetic Protein-2,hBMP2)真核表达载体,为在真核细胞的高效表达和基因治疗打下基础.方法:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室完成.①实验材料:含完整人骨形态发生蛋白2基因片段的pcDNA3.1/CT-hBMP2质粒由李曦铭博士惠赠;双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS(Invivogen公司),Zeo(Invivogen公司):pTA2R-T Easy(鼎国生物技术有限公司).②实验过程及评估:以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用聚合酶链反应方法亚克隆出人骨形态发生蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的蘑组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定.结果:①聚合酶链反应获得长度约1 216 bp的目的片段,与预期片段相符.②经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的骨形态发生蛋白2cDNA序列(NM-001200)100%匹配.结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2真核表达载体.     

可注射磷酸钙骨水泥填充固定羊胫骨平台骨折的体内生物力学研究

目的 比较磷酸钙骨水泥(CPC)与松质骨移植在修复羊外侧胫骨平台压缩性骨折中的体内生物力学特点.方法 成年健康山羊10只,双侧后肢制成外侧胫骨平台压缩性骨折模型,一侧以CPC填充(CPC组),对侧用自体骨填充(自体骨组).术后3个月和6个月各处死5只动物,取双侧胫骨观察关节面塌陷程度,摄X线片观察骨水泥降解情况,测定骨折部位抗压刚度,制备不脱钙切片观察关节面组织学改变.结果 自体骨组10个标本中的8个发生了骨折块的中重度下陷,CPC组只有3个发生了轻度下陷.X线片示3个月时骨水泥降解吸收被分割成几块,外形变模糊,6个月时大部分骨水泥被降解吸收.CPC组和自体骨组抗压刚度在3个月时分别为(226.89±62.81)N/mm和(172.97±79.82)N/mm,差异无统计学意义(t=1.369,P=0.243),6个月时分别为(471.27±212.89)N/mm和(371.05±207.98)N/mm,差异无统计学意义(t=0.948,P=0.397).组织学观察显示自体骨组关节面塌陷较严重,修复的软骨组织中纤维组织偏多;CPC组关节面软骨修复过程中对位较好,由纤维软骨形成相连接,纤维组织较少.结论 CPC的支撑效果好于自体骨,可在早期提供一定的抗压强度,防止胫骨平台关节面塌陷移位,有利于术后早期活动.     

构建含双顺反子绿色荧光蛋白标记人骨诱导形成蛋白2真核表达载体

背景:腺病毒虽可携带骨诱导形成蛋白2基因转染靶细胞促进其分泌诱导形成蛋白2,但容易出现一些免疫应答反应,以质粒为载体的转染实验应具有良好的前景.目的:验证构建绿色荧光蛋白标记的人骨诱导形成蛋白2真核表达载体的可行性.设计:单一样本观察.单位:天津医院.材料:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室(国家级)完成.含完整hBMP2基因片段的pcDNA3.1/CT-人骨诱导形成蛋白2质粒由李曦铭博士惠赠.双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS为Invivogen公司产品,Zeo购自Invivogen公司.pTA2(R)-T Easy为鼎国生物技术有限公司产品,限制性内切酶BamHI和NheI、T4 DNA连接酶(晶美生物工程有限公司),PCR上下游引物合成及测序(北京奧科生物技术有限责任公司).方法:以重组质粒pcDNA3.1/CT-人骨诱导形成蛋白2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法亚克隆出人骨诱导形成蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-人骨诱导形成蛋白2.主要观察指标:采用PCR法鉴定人骨诱导形成蛋白2序列,同时进行酶切及测序鉴定人骨诱导形成蛋白2是否克隆入pTA2-人骨诱导形成蛋白2重组质粒及真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS中.结果:PCR获得长度约1216bp的目的片段,经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的BMP2cDNA序列(NM-001200)100%匹配.结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白标记人骨诱导形成蛋白2真核表达载体.