大鼠脂肪间充质干细胞的成骨分化

目的:观察大鼠脂肪间充质干细胞经成骨诱导向成骨细胞分化的生物学特性,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:实验于2004-07/2006-03在中南大学湘雅医院中心实验室完成主要工作。①取健康SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫,消化法分离出脂肪间充质干细胞,接种入含有体积分数为0.1的新生牛血清的低糖DMEM培养基进行原代培养。②取第3代的脂肪间充质干细胞,用含有体积分数为0.1的新生牛血清、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基诱导其向成骨细胞分化。③于3,5,7,10,12,14,21d分别采用倒置显微镜观察细胞形态及增殖情况、Gomori改良钙钴法碱性磷酸酶染色、茜素红S钙结节染色和Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色检测脂肪间充质干细胞成骨分化的情况。结果:①脂肪间充质干细胞原代细胞呈成纤维细胞样长梭形外观,传代稳定,细胞形态均一。②经成骨诱导,脂肪间充质干细胞体积增大,呈多角形;成骨诱导14d,Gomori改良钙钴法碱性磷酸酶染色,细胞胞浆内可见浅棕色至棕黑色的颗粒,平均染色阳性率为80%;碱性磷酸酶活性随时间的延长而逐渐增高[3,5,7,10,12,14d依次为(2.43±0.09),(3.60±0.08),(5.01±0.09),(7.75±0.07),(9.59±0.09),(10.94±0.10)μkat/L];成骨诱导21d,钙结节形成明显,茜素红S染色,呈红色结节;成骨诱导7d,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,细胞胞浆呈棕黄色,胞核经苏木精复染为蓝色。结论:大鼠脂肪间充质干细胞经成骨诱导具有成骨细胞的生物学特性,可作为骨组织工程的种子细胞。     

脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化能力的研究

目的 探讨脂肪干细胞体外定向分化为软骨细胞的能力.方法 在特定培养基条件下,采用"微团"培养方法对脂肪干细胞进行成软骨诱导,于诱导7,14d后应用Ⅱ型胶原免疫组化和aggrecan免疫荧光检测成软骨表型;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测脂肪干细胞诱导0周、2周和4周后前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表达情况.结果 脂肪干细胞经诱导后,由长梭形转变为三角形、多角形或短梭形.逐渐聚集成结节,胞外基质Ⅱ型胶原免疫组化着色和aggrecan免疫荧光阳性,前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因均稳定表达.结论 脂肪干细胞在特定培养基条件下可以定向软骨细胞方向分化,并能够稳定表达软骨细胞特异袁型.     

三种生长因子对人胚半月板细胞增殖及细胞表型的影响

目的研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、转化生长因子β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）、胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor1,IGF-1）单独或联合作用于人胚半月板细胞,探讨半月板组织工程种子细胞大量扩增最佳作用组合及浓度。方法无菌条件下取健康妇女意外流产并自愿捐献的4个月人胚半月板,体外分离、培养半月板纤维软骨细胞,用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和Aggrecan免疫荧光染色检测其性状。取第3代细胞贴壁后使用血清饥饿法同步化细胞,加入IGF-1（1、10、50、100μg/L）、TGF-β1（0.1、1.0、5.0、10.0、50.0μg/L）、bFGF（5、10、50、100、200μg/L）作用于半月板细胞,每样本设8个复孔和阴性对照组,分别于作用后48h和72h采用MTT法检测软骨细胞增殖情况,以确定各生长因子最佳效应浓度。同法设7个组,每组8个复孔,分别为：阴性对照组、bFGF最佳效应浓度组（50μg/L）、TGF-β1最佳效应浓度组（5μg/L）、IGF-1最佳效应浓度组（50μg/L）、bFGF和TGF-β1最佳效应浓度联用组、bFGF和IGF-1最佳效应浓度联用组、TGF-β1和IGF-1最佳效应浓度联用组,48h和72h用MTT比色法得出吸光度（A）值并分析软骨细胞的增殖效应。结果第3代半月板细胞扩增前后细胞均表达Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白。48h和72h50μg/L IGF-1,5μg/L TGF-β1及50μg/L bFGF浓度组与对照组相比均具有促细胞增殖作用,且差异有统计学意义（P〈0.05）;此即为各生长因子最佳效应浓度。生长因子联用：bFGF50μg/L与IGF-150μg/L联用、IGF-150μg/L与TGF-β15μg/L联用具有协同效应,差异有统计学意义（P〈0.05）;bFGF50μg/L与TGF-β15μg/L联用无协同效应,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论bFGF、TGF-β1、IGF-1单独使用均可体外扩增人胚半月板细胞,最佳效应浓度联用时bFGF/IGF-1、IGF-1/TGF-β1的扩增效果优于各自单独使用,可用于体外大量扩增种子细胞。     

半侧骨皮质切除灭活回植治疗四肢低度恶性骨肿瘤

目的: 探讨半侧骨皮质切除灭活再植术治疗四肢低度恶性骨肿瘤的疗效。方法: 回顾性研究2005年1月至2011年1月行半侧骨皮质切除灭活再植术治疗四肢低度恶性骨肿瘤患者10例, 年龄(27.0±6.5)岁。病理检查显示骨旁骨肉瘤7例, 骨膜软骨肉瘤3例;按照Enneking方法分期, IA期8例, IB期2例。结果: 本组病例术后都得到随访, 随访时间为(50±23)月, 骨折断端都达到了骨性愈合。瘤段骨切除长度为(9.5±2.7) cm, 手术时间为(150±45)min, 出血量为(1000±350) mL, 术后48 h内拔除引流管, 引流量为(450±200) mL。术中1例(10.0%)患者出现残存骨骨折, 及时予以钢板螺钉内固定。1例(10.0%)患者出现局部复发, 予以扩大切除人工关节置换术, 无远处转移。根据Enneking等肢体肌肉骨骼肿瘤外科治疗重建术后功能评估标准, 功能评定优9例, 良1例。结论: 半侧骨皮质切除治疗骨表面低度恶性骨肿瘤安全有效。     

脂肪干细胞复合PLGA体外诱导成软骨的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞接种于PLGA支架复合培养体外诱导成软骨的能力.方法 收集脂肪干细胞,调整细胞悬液密度为4.0×1010>/L,接种在PLGA支架材料上进行复合,在特定培养基条件下,对脂肪干细胞/PLGA进行成软骨诱导,于诱导3周后应用扫描电镜观察,藩红O/固绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测成软骨表型;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表达情况.结果 脂肪干细胞接种子PLGA材料后,复合体表面逐渐光滑润泽,质地逐步增韧,体外诱导后细胞/PLGA支架复合体基本保持原状;3周时取材行扫描电镜观察,可见细胞在材料表面附着生长,基质分泌明显,连串成片;石蜡切片藩红O/固绿染色可见诱导组细胞胞外基质分泌旺盛,和支架材料连接成片,呈强阳性红染;胞外基质Ⅱ型胶原免疫组织化学着色阳性;RT-PCR检测前Ⅱ型胶原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因均阳性表达.结论 脂肪干细胞能够和PLGA复合培养,在特定诱导培养基条件下可以向软骨方向分化,形成类软骨样组织.     

开放切除手术治疗股骨小转子部骨样骨瘤的疗效分析

目的：探讨股骨小转子部骨样骨瘤的影像学特点和开放切除术治疗的疗效。方法：回顾性分析2013年7月 至2015年8月在中南大学湘雅二医院接受开放切除手术治疗的股骨小转子部骨样骨瘤患者14例，男9例，女5例，年龄 9~44(平均20)岁，病程3~36(平均8)个月。术前完善X线、CT和MRI检查，术后3个月内避免剧烈运动。结果：14例患 者中皮质型骨样骨瘤9例，骨膜型5例。9例患者可在X线片发现瘤巢，14例患者CT均可发现瘤巢。14例患者术前未服 用非甾体抗炎药的情况下，视觉模拟评分(visual analogue scale，VAS)平均6.5分。随访9~34(平均20)个月。患者术后1个 月VAS平均0分，随访中无疼痛症状复发，无感染，无血管神经损伤和骨折等并发症发生。结论：开放切除手术治疗 股骨小转子部骨样骨瘤，术后复发率低，并发症少，是一种较好的治疗方法。     

微球培养人脂肪间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化

目的:观察微球培养的人脂肪间充质干细胞在特定诱导条件下向软骨细胞的分化情况,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性。方法:实验于2006-03/08在湘雅医院中心实验室完成。①实验材料:皮下脂肪组织来源于股骨颈骨折手术患者6例,对本实验均知情同意。②实验方法:取皮下脂肪,分离培养脂肪间充质干细胞,胰酶消化,取传至第6代的细胞,密度调整为1×1010L-1进行接种培养,细胞贴附后加入软骨细胞诱导剂(含10μg/L转化生长因子β1、37.5mg/L维生素C、6.25mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、10-7mol/L地塞米松、1%新生牛血清的高糖DMEM),倒置显微镜下观察细胞团的变化。③实验评估:诱导14d后,将细胞吹散,细胞爬片,免疫组化染色检测Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺兰染色观察细胞内异染情况,RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白和软骨蛋白聚糖aggrecan mRNA的表达。结果:①脂肪间充质干细胞向软骨细胞诱导后的形态:诱导3d后,细胞团向内呈放射状聚集。②诱导后Ⅱ型胶原的表达及细胞内异染情况:诱导14d后,Ⅱ型胶原在胞浆、胞膜及细胞外基质中均有表达,呈棕黄色;甲苯胺兰染色显示胞浆内呈蓝色异染。③诱导前后Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan mRNA的表达:诱导前脂肪间充质干细胞无Ⅱ型胶原蛋白和aggrecan mRNA表达,而诱导14d后二者均有较高表达。结论:在微球状态下可成功诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化。     

不同方法诱导脂肪干细胞分化为类施万细胞

目的寻求一种有效的方法将脂肪干细胞在体外诱导分化为类施万细胞。方法采用2种不同的诱导剂使用方法诱导大鼠脂肪干细胞,从形态学、抗S-100、抗GFAP免疫细胞化学染色阳性率、染色灰度值,MTT法细胞活性测定来比较其效果的不同。结果2种方法均可有效地诱导大鼠脂肪干细胞分化为类施万细胞,改良法诱导的细胞在形态上更接近施万细胞,抗S-100、抗GFAP阳性率、染色灰度值均优于传统法;MTT细胞活性测定显示改良法对细胞活性影响较小。结论改良法体外诱导大鼠脂肪干细胞的效果优于传统法。     

瘤段切除灭活再植治疗儿童股骨恶性骨肿瘤

目的: 探讨瘤段切除灭活再植术在儿童股骨恶性骨肿瘤治疗中的疗效。方法: 回顾性研究2008年1月至2011年1月股骨恶性骨肿瘤行瘤段切除灭活再植术治疗的患者11例(男7例,女4例),年龄(11.0±2.5)岁。其中骨肉瘤10例,尤文氏肉瘤1例,按照Enneking方法分期,所有患者均为IIb期。结果: 本组病例术后都得到随访,随访时间24~65(42±20)个月,骨折端都达到骨性愈合。术中瘤段骨切除长度(17.5±3.2)cm,手术时间为(180±35)min,出血量(1200±250)mL。术后48h内拔除引流管,引流量为(650±125)mL。1例(9.1%)出现局部皮肤坏死,通过伤口换药3周后伤口逐渐愈合。3处(27.3%)骨折断端骨愈合不良,予以骨折断端自体髂骨植骨后,骨折端愈合。1例(9.1%)发生肺转移,于术后35个月死亡。根据Enneking等肢体肌肉骨骼肿瘤外科治疗重建术后功能评估标准,功能评定优5例,良4例,中1例,差1例,优良率81.2%。结论: 瘤段切除灭活再植术对于儿童股骨恶性骨肿瘤是一种可供选择的治疗方法。     

退变性腰椎管狭窄症伴脊柱侧凸的手术治疗

目的探讨退变性腰椎管狭窄症伴脊柱侧凸(degenerativelumbarspinalstenosiswithscoliosis,DLSSS)手术治疗的方法与疗效。方法采用后路椎管扩大减压、植骨融合、椎弓根螺钉内固定治疗DLSSS患者15例。结果术后随访3～4年6个月(平均3年5个月),术后1年、3年临床疗效优良率为93.3%。结论后路椎管扩大减压、植骨融合、椎弓根螺钉内固定是治疗退变性腰椎管狭窄症伴脊柱侧凸的有效手术方式。