四环素调控系统修饰永生化大鼠星形胶质细胞株的构建及鉴定

目的构建四环素及其衍生物强力霉素诱导表达目的基因的永生化大鼠星形胶质细胞株。方法用脂质体法将逆转录病毒载体四环素调控系统中的质粒pRevTet-On转染病毒包装细胞 PT67,经筛选培养后获得病毒载体RevTet-On,采用RT-PCR进行鉴定,并应用NIH313细胞测定病毒滴度。将RevTet-On感染永生化大鼠星形胶质细胞,用有限稀释法挑选阳性细胞单克隆后扩大培养,每个克隆瞬时转染含萤光素酶报告基因的质粒pRevTRE-Lue,加入强力霉素48h后分别检测其萤光素酶活性值,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低的细胞株并检测其诱导表达的时效、量效关系。结果 RT-PCR结果显示逆转录病毒包装成功,病毒最高滴度为7．4×105CFU／ml。RevTet-On转染永生化大鼠星形胶质细胞后挑选出48个单克隆,瞬时转染pRevTER-Luc后筛选出1株高表达低背景细胞株, 其诱导表达值为876．1 RLU,背景表达值为42．5 RLU,诱导倍数为20．6。该细胞株在加入诱导因子强力霉素1 h后目的基因即开始表达,在24 h时达到高峰,在强力霉素浓度100-2 000 ng/ml的范围内, 其诱导表达活性与药物浓度呈剂量依赖性。结论含四环素调控系统的永生化大鼠星形胶质细胞株诱导活性可靠,可用于调控表达外源基因的研究。     

面瘫膏配体针治疗陈旧性面瘫50例

面瘫膏配体针治疗陈旧性面瘫５０例安珂（甘肃省中医院，兰州市７３００７０）主题词面神经麻痹／中医药疗法，中药外敷陈旧性面瘫是指病程在６个月以上尚未恢复的茎乳突孔内非化脓性面神经炎，亦称周围性面神经麻痹。笔者１９９０～１９９５年采用自制面瘫膏外敷配合体针...     

增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞株的表达

目的:研究重组腺相关病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因在永生化大鼠神经前体细胞的转染效率及其表达情况. 方法:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒转染永生化大鼠神经前体细胞,持续观察转基因神经前体细胞绿色荧光蛋白的表达情况,并计算转染效率. 应用巢蛋白抗体和抗猿肾病毒40大T抗原抗体进行细胞鉴定,50 mL/L胎牛血清诱导细胞分化后,应用神经元和星形胶质细胞特异性标志物抗体检测其分化能力. 结果:荧光显微镜观察显示转染后24 h神经前体细胞即有绿色荧光蛋白表达,转染后72 h,大部分细胞表达绿色荧光蛋白,转染效率可达90%. 经传代培养8 wk后,表达绿色荧光蛋白的阳性细胞仍可高达70%～75%. 免疫细胞化学结果显示转绿色荧光蛋白神经前体细胞巢蛋白和抗猿肾病毒40大T抗原抗体染色均为阳性,50 mL/L胎牛血清可诱导其分化为神经元和星形胶质细胞. 结论:携带增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒可高效转染永生化大鼠神经前体细胞,并可在细胞中长期稳定地表达,绿色荧光蛋白作为良好的示踪剂可应用于神经前体细胞的体内移植.     

N-甲基-D天冬氨酸受体2B亚基重组腺病毒穿梭载体的构建及鉴定

目的：构建携带N-甲基-D天冬氨酸（NMDA）受体2B亚基（NR2B）基因的腺病毒5型（Ad5）穿梭载体，为NR2B重组腺病毒镇痛疫苗的包装做准备。方法：以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pcDNA3．1-NR2B获得目的基因NR2B；将NR2B定向克隆入腺病毒穿梭载体pDC515，并行酶切及DNA测序鉴定。在脂质体介导下将pDC515-NR2B转染293细胞，并以RT-PCR及Western blot分别从转录水平和翻译水平检测目的基因NR2B的表达。结果：经酶切和DNA测序证实目的基因NR2B被成功克隆入载体pDC515-NR2B中，RT-PCR及Western blot检测NR2B可在293细胞表达。结论：成功构建NR2B重组Ad5穿梭载体pDC515-NR2B，该载体可用于NR2B重组Ad5载体镇痛疫苗的包装。     

阅尽千帆，世间始觉你最好

子怡是一个很阳光的女孩。她喜欢笑，笑起来露出两个可爱的酒窝，很有感染力，我甚至没有看见过她悲伤，她给人的永远是暖暖的感觉。 刚上大学半年，我发现班里稍有姿色的女生几乎全有了男朋友，而且大部分是大二大三的男生。     

N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基抗原表位DNA疫苗免疫大鼠的效应

目的 采用N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基抗原表位(eNg2B)插人质粒载体pDC515中制备的DNA疫苗(pDC515/eNR2B)免疫大鼠,评价其免疫效应.方法 成年雄性SD大鼠40只,体重200～250 g,随机分为4组:对照组(C组)、PBS组、pDC515组和pDC515/eNR2B组,每组10只.PBS组、pDC515组和pDC515/eNR2B组分别肌肉注射PBS 100 μl、pDC515 100 μg和pDC515/eNR2B 100 μg进行免疫,1周后以等剂量再次免疫.于第1次免疫前、第2次免疫后8、14、21 d时,截尾法采集尾静脉血,分离血清,ELISA法检测NR2B抗体水平.于第2次免疫后21 d时处死大鼠取脊髓,分别采用免疫组织化学法和Western blot法检测NB2B抗体与自身腰段脊髓组织NR2B特异性结合情况.结果 第2次免疫后8 d,pDC515/eNR2B组血清中可检测到NR2B抗体,14 d时达高峰,并高滴度持续至21 d(P＜0.05);C组、PBS组和pDC515组均未检测到相应NR2B抗体;免疫组织化学法和Western blot法检测到pDC515/eNR2B组血清NR2B抗体可与自身脊髓组织NR2B结合.结论 pDC515/eNR2B可诱导SD大鼠产生体液免疫反应,所产生的自身抗体在血液中可高滴度存在一定时间.     

用于包装复制缺陷性腺病毒的低代次293细胞的培养

目的:建立体外培养低代次293细胞的方法.方法:细胞复苏,将冻存的低代次293细胞于37℃水浴中快速融解,移入75 cm2细胞培养瓶中,加入10 mL低代次293细胞培养基,6～8 h细胞贴壁后更换培养基.细胞传代,吸出培养基,用1×柠檬酸盐细胞消化液洗2遍,留取0.5 mL 37℃消化5～10 min,待细胞脱壁后加入3 mL培养基,轻轻吹匀以1:2比率传代培养.细胞冻存,以1×柠檬酸盐细胞消化液消化5～10 min,细胞脱壁后加入5 mL细胞培养基中和消化液,离心收集细胞,以1 mL的细胞冻存液(90% FBS+10% DMSO)重悬、冻存.结果:细胞传代后8h细胞完全贴壁;以腺病毒感染质粒感染293细胞14 d后可观察到腺病毒空斑形成.结论:该方法操作简便,对细胞损伤小且保持细胞生物学特性不变.     

针刺治疗突发性耳聋37例

目的：观察针刺治疗突发性耳聋的疗效。方法：对37例经电测听力等检查确诊为突发性耳聋患者采用针刺进行治疗,同时设对照组37例。对两组的疗效及治疗时间进行观察和比较。结果：针刺组在疗效和治疗时间上均优于对照组（P〈0．01）。结论：针刺疗法是治疗突发性耳聋的有效方法,值得临床推广引用。     

N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基基因重组腺病毒镇痛疫苗的构建

目的 构建携带N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)基因的重组腺病毒镇痛疫苗.方法 以携带NR2B基因的腺病毒穿梭质粒pDC515-NR2B和腺病毒骨架质粒pBHGfrt(del)E1,3FLP共转染腺病毒包装细胞293细胞,连续观察细胞的形态学.取形成病毒空斑的293细胞,分别采用PCR、RT-PCR及Western blotting的方法从基因水平、转录水平和蛋白水平对病毒空斑筛选和鉴定,对鉴定正确的病毒空斑进行扩增和纯化.结果 转染后12 d可观察到细胞病变效应,15 d后形成病毒空斑.NR2B基因不仅正确插入重组腺病毒载体,而且可在293细胞正确表达NR2B蛋白.鉴定正确的病毒空斑命名为NR2B基因重组腺病毒5型镇痛疫苗,滴度为5×1011 VP/ml,纯度100%.结论 成功地构建了NR2B基因重组腺病毒镇痛疫苗,可用于疫苗镇痛的研究.     

甘丙肽及其受体在痛觉调控中的作用

甘丙肽广泛分布于外周和中枢神经系统，具有广泛的神经生物学功能，是一种内源性镇痛物质，脊髓水平的甘丙肽及其受体参与神经系统伤害性信息的调控。现就其研究进展作一综述。