人类胚胎干细胞的研究现状与趋势

胚胎干细胞是来源于早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞的一种多潜能性细胞,具有自我更新和多向分化的潜能。胚胎干细胞在临床移植医学、细胞治疗、组织工程、生物学基础研究等领域具有重要的科学意义和巨大的应用前景。     

原始生殖细胞的凋亡

目的：分析原始生殖细胞凋亡的现象及机制，以期更深入地认识人类及其他动物原始生殖细胞培养过程中细胞凋亡的问题。 资料来源：计算机检索Medline 1990—01／2005—12相关原始生殖细胞凋亡的文献，检索词“蹦mordial germ cells（PGCs），Apoptosis”，并限定文献语言种类为English。同时检索CNKI 1990-01／2005-12相关原始生殖细胞凋亡的文献，检索词为“原始生殖细胞，凋亡”，并限定语言种类为中文。 资料选择：对资料初审，选取包括原始生殖细胞凋亡方面的文献，开始查找文献。纳入标准：①原始生殖细胞凋亡。②哺乳动物生殖细胞凋亡。排除标准：①综述文献。②重复研究类文章。资料提炼：共收集到45篇关于哺乳动物生殖细胞凋亡的文献，纳入27篇符合标准的文献。资料综合：原始生殖细胞是精子和卵子的前体细胞。雌雄性生殖细胞在体正常发育过程都会发生凋亡，体外培养原始生殖细胞也会凋亡。原始生殖细胞凋亡具有一般细胞凋亡的特征。白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子等细胞因子，纤粘连蛋白和层粘连蛋白等胞外基质和饲养层细胞等能抑制体外培养的原始生殖细胞凋亡，促进其存活和增殖。蛋白酶抑制剂如α2-巨球蛋白，2-硫基乙醇、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽等抗氧化剂能够阻断由于活性氧水平升高而引发的细胞凋亡。 结论：在体正常发育过程和体外培养的原始生殖细胞和雌雄性生殖细胞都会发生凋亡。有关原始生殖细胞和雌雄性生殖细胞发生凋亡的机制值得深入研究。     

牛胚胎干细胞分离克隆及定向分化研究

胚胎干（embryonic stem,ES）细胞自Evans和Kanfman（1981）首次从小鼠胚胎中分离到后,胚胎干细胞技术一度成为各国学者研究的热点。ES细胞是自附置前早期胚胎或附置后胚胎原始生殖细胞分离克隆的一种具有自我更新和全向分化潜能的细胞,其具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能,同时又可以在体外进行培养、扩增、转化、筛选和冻存。它为克隆治疗以及深入研究基因结构与功能、胚胎发育、各种遗传病模型以及克隆动物和转基因动物等提供了新型实验材料。ES细胞在发育生物学基础研究、组织工程研究、临床医学等方面具有诱人的应用前景和重要的科学意义。本研究以牛为实验材料,探讨影响牛ES细胞分离克隆的因素,完善牛ES细胞的分离克隆程序,为人类ES细胞的研究提供相关的技术参数,主要取得了如下几方面的成果。     

牛卵母细胞体外成熟的研究

为了给牛细胞核移植提供卵母细胞 ,1 997年 3月至 2 0 0 1年 3月共进行了 86次卵母细胞体外成熟的实验研究 ,核成熟率 (以出现第一极体为成熟标志 )为 6 5.1 2 %( 2 332 /372 1 )。其中 ,基础培养液为TCM1 99+ 0 .1 2mg/ml丙酮酸钠 + 1 0mMHepes+ 8%NCS + 1 0 μg/mlFSH + 1 0 μg/mlLH + 1 μg/mlE2 (培养液 1 )组进行 6 8批次实验 ,核成熟率为 57.97% ( 1 6 80 /2 898)。基础培养液为TCM 1 99+ 0 .1 2mg/ml丙酮酸+ 8%的发情牛血清 (为 4头发情牛的混合血清 ,培养液 2 )组进行 1 8次实验 ,核成熟率为 79.2 2 % ( 6 52 /82 3)。培养液 1组与培养液 2组之间卵母细胞成熟率差异显著(P <0 .0 5)。培养液 2的组中有 9次添加了 40IU/ml的庆大霉素 ,其核成熟率为72 .1 5% ( 342 /4 74) ;另 9次未添加庆大霉素 ,其核成熟率为 88.83% ( 31 0 /349) ,两者之间无明显差异 (P >0 .0 5)。此外本研究对以去核卵母细胞激活后分裂率作为卵母细胞质成熟的标准作了初步的探讨     

牛-山羊异种克隆早期胚的分叶状线粒体

利用牛卵母细胞和山羊耳皮肤成纤维细胞制作异种克隆胚,分别于激活后1、36、44、60、144 h,观察发育情况,并收集原核期胚,2-细胞胚,4-细胞胚,8-细胞胚和桑甚胚.光镜检查各时期胚,分别选取形态良好的5枚,用2.5%的戊二醛固定24 h后,用1.5%锇酸后固定40 min,再用乙醇逐级脱水并用丙酮置换,Epon-812包埋,最后包埋块放入烤箱内聚合（37℃,24 h,45℃,24 h;60℃,24 h）.     

原始生殖细胞的凋亡

目的:分析原始生殖细胞凋亡的现象及机制,以期更深入地认识人类及其他动物原始生殖细胞培养过程中细胞凋亡的问题。资料来源:计算机检索Medline1990-01/2005-12相关原始生殖细胞凋亡的文献,检索词“Primordialgermcells(PGCs),Apoptosis”,并限定文献语言种类为English。同时检索CNKI1990-01/2005-12相关原始生殖细胞凋亡的文献,检索词为“原始生殖细胞,凋亡”,并限定语言种类为中文。资料选择:对资料初审,选取包括原始生殖细胞凋亡方面的文献,开始查找文献。纳入标准:①原始生殖细胞凋亡。②哺乳动物生殖细胞凋亡。排除标准:①综述文献。②重复研究类文章。资料提炼:共收集到45篇关于哺乳动物生殖细胞凋亡的文献,纳入27篇符合标准的文献。资料综合:原始生殖细胞是精子和卵子的前体细胞。雌雄性生殖细胞在体正常发育过程都会发生凋亡,体外培养原始生殖细胞也会凋亡。原始生殖细胞凋亡具有一般细胞凋亡的特征。白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞因子等细胞因子,纤粘连蛋白和层粘连蛋白等胞外基质和饲养层细胞等能抑制体外培养的原始生殖细胞凋亡,促进其存活和增殖。蛋白酶抑制剂如α2-巨球蛋白,2-硫基乙醇、N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽等抗氧化剂能够阻断由于活性氧水平升高而引发的细胞凋亡。结论:在体正常发育过程和体外培养的原始生殖细胞和雌雄性生殖细胞都会发生凋亡。有关原始生殖细胞和雌雄性生殖细胞发生凋亡的机制值得深入研究。     

兔骨髓基质细胞核移植的初步研究

目的 通过建立骨髓基质细胞核移植的方法，为进一步从克隆囊胚的内细胞团细胞分离培养出全能性的胚胎干细胞并用于治疗性克隆等研究奠定基础。方法 超排获得的兔成熟卵母细胞去核后，将同种的单个骨髓基质细胞核注入其内；电融合后，经离子霉素（ionomycin）和6-甲氨基嘌呤（6-DMAP）激活，用10％胎牛血清（FBS）的TCM-199进行体外培养直至囊胚阶段。结果 实验对147个卵母细胞去核，去核成功率为70．75％（104／147）；注核后有82．69％（86／104）的卵细胞保持形态完整；重构后的体细胞-卵母细胞质复合体经电融合后的融合率为56．79％（46／81）；激活后的重构胚于体外培养后分裂率为65．22％（30／46），囊胚率为17．39％（8／46），获得的囊胚有62．5％（5／8）进入孵化阶段；孵化出来的细胞贴壁生长并向周围扩展，显示了具有向下一阶段发育的潜能，为从囊胚内细胞团细胞中分离并培养出胚胎干细胞提供了可能。结论 实验结果表明，以兔成体体细胞的骨髓基质细胞为核供体，经克隆技术生产出囊胚并从中分离内细胞团细胞具有可行性。     

成年山羊皮肤干细胞的分离与克隆

干细胞研究是当今生命科学研究的热点之一。至今 ,科学家们已成功分离到胚胎干细胞 (embryonicstemcells)、造血干细胞 (hematopoieticstemcell)、神经干细胞(neuralstemcell)和骨髓间质干细胞 (mesenchymalstemcell)等。而对于成年动物皮肤组织是否存在干细胞 ,长期以来科学家们仅从皮肤形态发生、创伤组织修复过程中的细胞动力学论证推测 ,认为皮肤基底层细胞具有多能性 ,类似干细胞。最近 ,《cell》报道了由法国科学家YannBarrandon领导的研究小组的研究结果 ,成年小鼠皮肤毛囊中含有干细胞 ,它可以生成组建表皮、皮脂腺和毛囊所需的所有类型的细胞[1] 。而关于成年山羊皮肤干细胞分离克隆的研究 ,还未见相关报道。本研究以成年奶山羊耳尖皮肤为材料 ,以TCM1 99为基础培养基 ,添加IGF - 1等细胞因子 ,成功分离到皮肤类干细胞并克隆 3代冷冻保存