rhGM-CSF基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞和小鼠体内的表达

将ｈＧＭＣＳＦ基因克隆至真核表达质粒ｐＣＤＳ中，构建成重组质粒ｐＣＧ１。用电穿孔法将质粒ｐＣＧ１导入ＣＯＳ７细胞和直接注射小鼠骨骼肌内，ＥＬＩＳＡ检测显示质粒ｐＣＧ１转染ＣＯＳ７细胞后４８、７２、９６ｈ和肌注质粒ｐＣＧ１后ｄ１０、ｄ１５、ｄ２０、ｄ２５小鼠体内均有ｈＧＭＣＳＦ的表达。生物学活性检测显示含肌注ｐＣＧ１的小鼠血液有维持ＴＦ１细胞生长的作用，表明重组质粒ｐＣＧ１表达分泌的ｈＧＭＣＳＦ具有生物学活性     

从小牛胸腺分离纯化末端脱氧核苷酸转移酶

末端脱氧核苷酸转移酶(以下简称TdT)能催化脱氧核苷三磷酸在寡聚或多聚脱氧核苷酸以及DNA的3′—OH端的聚合反应,不需要模板。TdT是遗传工程试验中的重要工具酶之一,利用这种酶在一条DNA分子的3′—OH端加上一个同聚物,     

广州市一起志贺氏菌痢暴发的分子流行病学分析

本文对61株福氏2a(Shigella flexneri 2a)分离株进行了耐药谱、质粒图谱、菌落原位杂交和Southern blot分析。结果显示:从广州1992年暴发的一起菌痢流行中分离的30株暴发株和当年在广州分离的28株散发株的耐药谱和质粒图谱相同,而且菌落原位杂交证明它们均有4.7kb的ipaBC基因,Southern blot进一步指出了上述分离株的ipa BC基因位于7.6kb,2.5kb和1.6kb的EcoR Ⅰ片段。从分子水平证明了1992年广州市一起志贺氏菌痢(幅氏2a)暴发为单一克隆株引起,该克隆为当地1992年福氏菌的优势克隆。而福州1991年分离的3株同型菌分属不同的克隆。     

乙型肝炎病毒adw亚型基因组在大肠杆菌中的克隆

乙型肝炎是严重危害人类健康的一种疾病,其感染率相当高,尤其在亚洲及非洲地区某些国家更高。患者中有相当数量成了慢性患者,致使劳动力丧失,部分导致肝硬变、肝坏死和肝癌。乙型肝炎的病原是乙型肝炎病毒(HBV),存在于感染者的血浆或肝细胞中,在感染者的血浆中为42nm球状的Dane颗粒结构,HBV感染的免疫学标志有表面抗原(HBsAg)、“e”抗原(HBeAg)及其相应的抗体和抗核心抗原(HBcAg)的抗体。     

利用PCR技术优化人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因

本研究利用ＰＣＲ技术将人单核细胞趋化蛋白－１基因（ＭＣＰ－１）５′端翻译起始区进行优化改构。结果表明，改构后的ＭＣＰ－１基因克隆入大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０中，ＤＮＡ测序证实正确。上述结果为进一步研究ＭＣＰ－１的高效表达奠定了基础。     

制备电泳分离回收DNA片断

从凝胶中回收DNA片断已有不少报导:机械破碎凝胶和从凝胶基质扩散DNA,电洗脱;玻璃粉法和DEAE—纤维素纸法。这些方法各有利弊。我们基本上参照Strongin等的电洗脱法,从凝胶中回收DNA,其回收率达到80％左右,不含有凝胶基质的污染,所得DNA是均一的,可用作同位素标记探针,酶切分析和重组克隆。     

rhGM-CSF cDNA直接注射小鼠骨骼肌的体内表达研究

将外源基因直接注入动物体内并获得表达，是近几年发展起来的一种新的基因疗法。该方法操作简便，临床易于接受。天然ＧＭ－ＣＳＦ在体内产生的量极少，本研究将ｈＧＭ－ＣＳＦ基因直接注入小鼠体内，以使小鼠体内产生自身所需要的天然ｈＧＭ－ＣＳＦ。首先将ＰＣＲ扩增的ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段平端插入真核表达质粒ｐＣＤＳ中，构建成重组质粒ｐＣＧＩ；然后采用电击法转染ＣＯＳ－７细胞，ＥＬＩＳＡ法检测结果显示转染后２４，４８，７１和９６小时细胞上清有ｈＧＭ－ＣＳＦ的表达分泌。说明重组质粒ｐＣＧＩ能表达分泌ｈＧＭ－ＣＳ…     

Vi抗原影响产肠毒素大肠杆菌菌毛 在人伤寒沙门菌表面的装配

目的 观察人伤寒沙门菌Vi抗原对大肠杆菌菌毛抗原装配的影响。方法 利用体内、外同源重组系统,构建了VipR基因缺失突变的人伤寒沙门菌菌株,导致其Vi抗原的表达较相应野生菌株偏低。用包含产肠毒素大肠杆菌菌毛抗原基因的表达质料分别转化Vi表达弱化菌株和相应野生菌株,对两者表达的菌毛抗原进行含量分析。结果 产肠毒素大肠杆菌CS3、CFA－I在VipR突变体菌株表面的含量,均比在相应野生菌株表面的含量高。结论 Vi抗原的表达弱化可能有利于菌毛抗原在人伤寒沙门菌表面的装配。本研究结果对于产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗的构建有指导意义。     

志贺氏菌属的致病因子及其菌苗研究进展

痢疾是一种在全世界范围内流行的传染病,由志贺氏菌属引起。志贺氏菌有4个种群:福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌。除宋内氏菌以外,每个种群还有不同的血清型。 迄今已知志贺氏菌的主要致病因子有:位于志贺氏菌大质粒上与侵袭力相关的基因,其功能是使志贺氏菌能进入人的肠上皮细胞;位于志贺氏菌染色体上的脂多糖基因,其功能与已进入宿主细胞的志贺氏菌的增殖相关;志贺氏毒素,它是由Ⅰ型痢疾志贺氏菌产生,其基因也位于染色体上,它具有肠毒、细胞毒和神经毒作用;此外,志贺氏菌对铁的吸收能力和温度也是志贺氏菌毒力的调节因子。 痢疾菌苗的研制始于本世纪40年代,起初从胃肠道外途径用死菌苗对志愿者进行了现场试验,结果表明死菌苗没有明显的保护作用。后来采用口服途径、但口服死菌苗对人体也没有保护作用,而口服减毒活菌苗有保护作用。但这些菌苗减毒的遗传背景不清楚,存在回复突变的可能性。现已构建了毒力基因缺失的减毒株,这种减毒株不可能发生回复突变成有毒株,很有希望成为理想的痢疾菌苗候选株。     

逆转录病毒载体介导人GM－CSF基因转染肿瘤细胞

应用逆转录病毒载体ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）介导人ＧＭ－ＣＳＦ基因转染肿瘤细胞获得表达。经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将含有人ＧＭ－ＣＳＦ基因的重组逆转录病毒载体ｐＺＩＰ－ＧＭ转染兼性病毒包装细胞系ＰＡ３１７，继之用病毒收获液感染人肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１和人胃癌ＢＧＣ－８２３，经ＧＭ－ＣＳＦ依赖细胞株ＴＦ１测活和双抗体夹心法ＥＬＩＳＡ测定表明：人ＧＭ－ＣＳＦ基因在人肿瘤细胞中获得稳定高效表达。为进─步建立ＧＭ－ＣＳＦ的转基因治疗模型提供了基础。