增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）自身增强子I（enhancerI，ENHI）对HBV DNA疫苗免疫应答的影响。方法 采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原（HBsAg）和HBsA-ENHI基因片段，重组到载体VR1012中，构建两种HBV DNA疫苗，转染CADS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB／c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果 转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHI的HBV DNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高，两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异；免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHI可使HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加，对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB／C小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)自身增强子Ⅰ(enhancerⅠ,ENHⅠ)对HBVDNA疫苗免疫应答的影响。方法采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原(HBsAg)和HBsAg-ENHⅠ基因片段,重组到载体VR1012中,构建两种HBVDNA疫苗,转染COS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB/c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHⅠ的HBVDNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高,两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异;免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHⅠ可使HBVDNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加,对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB/c小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

HIV核心抗原p24原核系统的高效表达、纯化及活性鉴定

目的　在原核表达系统中对HIVp2 4抗原基因进行克隆和高效表达、纯化并鉴定其活性。方法　利用PCR技术从HIV-1全基因质粒 (B2N)中扩增p2 4抗原基因 ,并克隆入T载体中。通过酶切消化后连接到表达载体pRSET上 ,用此连接产物转化大肠埃希菌BL2 1,经IPTG诱导 ,表达p2 4抗原。利用固定化金属离子 (Ni2 )配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白。并运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳、WesternBlot(WB)及ELISA法分别对插入基因片段的正确性、表达产物的活性及特异性进行检测。结果　PCR产物约为 6 90bp ,与预期p2 4抗原全基因片段大小一致。重组质粒T-p2 4和pRSET-p2 4经BamHⅠ和HindⅢ双酶切 ,其插入的外源基因片段均为 6 90bp。将纯化前与纯化后的蛋白作SDS PAGE电泳 ,均可见一条约 2 4× 10 3的外源基因表达带 ,与计算的相对分子质量相符。经WB和ELISA试验 ,证明基因工程表达的p2 4抗原具有较高的特异性及活性。结论　成功构建了HIVp2 4表达载体pRSET-p2 4 ,并在原核细胞中高效表达 ,其表达产物具有良好的特异性及活性     

HIV多抗原位点串联基因的表达及活性鉴定

目的在原核表达载体系统中对HIV—1／2型外壳蛋白多个抗原位点串联基因进行表达、纯化并鉴定其活性。方法人工合成含HIVgp41的2个抗原位点、gp120的3个群的各3个抗原位点及gp36的2个抗原位点的串联基因，克隆到原核表达载体pRSETB中，构建重组表达质粒pRSETB-env，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达，利用固化金属离子配体亲和层析技术纯化表达蛋白．利用逐渐降低尿素浓度透析法使目的蛋白复性。用免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定。结果目的基因在BL21中有较高表达率，纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见一条约32KD的蛋白带．与设计分子量相符。免疫印迹、ELISA试验显示该表达蛋白可与HIV患者血清较好结合．而与其它患者血清无交叉反应。结论成功构建了由HIV外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env，并在原核细胞中高效表达，表达蛋白经一步纯化后纯度较高．并具有良好特异性和活性。     

抗人红细胞抗体和HIV抗原融合蛋白的构建及活性鉴定

目的构建及表达抗红细胞(RBC)单链抗体(ScFv)和HIV抗原的融合蛋白,并做活性测试。方法将鼠抗人红细胞单链抗体可变区重链、轻链基因与HIV抗原基因相连,重组于高效表达载体中,并在大肠埃希菌中表达。结果经ELISA检测和红细胞凝集检测,证明表达的融合蛋白具有HIV抗原和抗人红细胞的双重活性,可使含有HIV抗体的红细胞悬液凝集。结论融合蛋白构建成功,可用于HIV的快速检测。     

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2 4抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础     

HIV辅助受体结合位点配体基因的获得及合成配体体外抑制作用的研究

目的 从构建的噬菌体十肽库中筛选HIV辅助受体的配体，测序后人工合成配体并研究其体外抑制HIVgp120．抗原的活性。方法 采用噬菌体表面表达技术，构建具有一这库容量的噬菌体随机十肽库。以HIVgp120多肽做抗原，经过五轮的亲和筛选获得高亲和力的配体，测序后人工合成配体肽，以ELISA试验检测配体的抑制活性。结果 获得1个与HIV辅助受体结合位点有高亲和力的配体克隆。经核苷酸序列测定，推导出该配体的氨基酸序列并人工合成该配体多肽。结论 筛选得到的展现在噬菌体表面的配体及人工合成的配体，对HIV辅助结合位点均有较好的封闭作用。     

人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用

目的 建立人类肠道病毒（HEV）分子生物学分型鉴定方法,用于临床分离肠道病毒的分型鉴定.方法 根据已知各型别人类肠道病毒基因的核苷酸序列和文献资料,分别合成HEV种属特异性和分型鉴定引物;提取病毒RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒cDNA,通过琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列分析,鉴定病毒并分型,并与血清中和试验相互验证.结果 采用种属特异性引物鉴定18株疑似HEV毒株,其中17株阳性;型特异性引物鉴定结果：18株病毒中4株为科萨奇病毒A24型,3株为科萨奇病毒B3型;科萨奇病毒B2、A9、A15型、埃可病毒3、6、7、9、11、14、33型和鼻病毒9型各1株,分型结果与中和试验相符.结论 建立的人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法,具有特异性强、敏感性高、快速简便等优点,可以直接鉴定并分型诊断人类肠道病毒感染,适用于人类肠道病毒感染的实验室诊断和流行病学研究.     

人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点Fab单克隆抗体基因的获得

目的：筛选人源抗HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因。方法：根据HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点的氨基酸序列合成23肽，并以此为固相抗原从HIV－1噬菌体Fab抗体库筛选阳性克隆，并进行鉴定及序列测定。结果：获得了1株抗HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点的人源Fab抗体克隆，具有较高的亲和力、特异性和抑制率，序列测定及分析显示该抗体属IgG I亚类，κ型，重、轻链可变区分别属VhⅢ和VκⅢ基因家族。结论：成功地获得了人源抗HIV－1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因。     

丙型肝炎病毒特异性核酶细胞内切割活性的研究

设计合成针对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心区基因（第３８４－３８６ｎｔ）的锤头状核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ,Ｒｚ）,从丙型肝炎病人的血清中提取ＨＣＶ ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＨＣＶ基因片段（４１２ｂｐ）,作为核酶的靶序列,将核酶基因和ＨＣＶ靶基因片段分别克隆人反转录病毒载体ｐＬＸＮ中构建重组载体,并用电击法分别转入包装细胞ＲＡ３１７中,将上述两种细胞释放到培养液中的含Ｒｚ的假病毒颗粒和含ＨＣＶ靶基因的假