多发性脂囊瘤患者角蛋白17基因突变的研究

目的 了解多发性脂囊瘤和角蛋白17基因异常的关系。方法 应用逆转录-聚合酶链反应及其产物直接测序,巢式聚酶链反应及限制性片段长度多态性分析。研究多发性脂囊瘤家系中患者患肿组织cDNA及外周血DNA的角蛋白17基因突变。结果 囊肿组织显示角蛋白17基因第94位密码子,428碱基发生C→A的突变,使原编码的氨基酸曲精氨酸变为半胱氨酸,即R94C的杂合突变。巢式聚合酶链反应后Acil限制酶谱多态性分析,显示患者多周血DNA标本均有一条突变等位基因缺乏该酶酶切位点,产生200bp的条带,另有一条野生型等位基因已被切开,形成2条带,分别为108bp,92bp,进一步证实R94C的突变,系杂合性突变,而正常人10人份及2000人份正常人DNAPool标本2条等位基因均有Acil的酶切位点,只显示108bp和92bp3条带。结论 角蛋白17基因R94C的突变,是导致中国人多发性脂囊瘤的遗传学基础之一。这一研究结果为该病的基因诊断及遗传咨询提供了科学依据。     

首次在我国发现多发性脂囊瘤患者角蛋白17的突变

多发性脂囊瘤(ｓｔｅａｔｏｃｙｓｔｏｍａｍｕｌｔｉｐｌｅｘ)也称为多发性皮脂囊肿,是一种少见的常染色体显性遗传病,以全身多发性皮肤囊肿为特点。1994年我们在徐州市遗传病流行病学调查中发现3例患者,为一个家系成员。经追踪调查,在此家系5代人中共发现患者31例。1998年4月我们与中国科学院上海生物工程中心合作开始对该家系进行基因分析,应用连锁分析、ＲＴ-ＰＣＲ、限制性片段长度多态性和序列分析等方法首次在国内证实该家系患者角蛋白(ｋｅｒａｔｉｎ)17第94位密码子发生突变,使原编码的氨基酸由精氨酸变为半胱氨酸,即Ｒ94Ｃ的错义…     

印迹基因SGCE在原发性肝细胞癌中的表达及其意义

目的 探讨印迹基因SGCE在原发性肝细胞癌中的表达及其意义.方法 构建肝癌组织的基因表达谱文库,并对肝癌和正常肝脏组织基因表达谱的数据进行比较分析,寻找差异表达基因.收集临床组织样本,应用荧光定量PCR方法,检测肝癌和相应癌旁组织中SGCE和PEG10基因的表达水平.结果 基因表达谱数据提示,印迹基因SGCE的表达水平...     

逆向点杂交方法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的 建立一种灵敏、特异、快速检测结核分支杆菌耐药相关基因突变的方法，用于临床对利福平耐药的快速诊断。方法 将14条特异性探针固定在尼龙膜上，通过在下游引物标记生物素的方法得到生物素标记的结核分支杆菌DNA PCR扩增产物，与固定在尼龙膜上的特异性探针杂交，杂交物通过链酶亲和素标记辣根过氧化物酶及底物（四甲基联苯胺）显色判定结果。将杂交结果与基因测序结果及药敏试验结果进行对比分析。结果 采用逆向点杂交法共检测23株耐利福平及11株敏感型菌株，与药敏试验结果、测序结果符合率分别为28／34和30／34。所发现突变类型依次为：第531位突变11株，第526位突变7株，第533位突变3株。未检测到第516位、第513位碱基突变。结论 该方法可用于临床结核分支杆菌对利福平耐药性的快速检测。     

人血清脂联素定量ELISA检测方法的建立及初步临床应用

目的:建立一种检测人血清中脂联素(APN)的酶联免疫吸附方法(ELISA),并初步探讨其在冠心病诊断中的应用。方法:构建表达质粒pET22b(+)/gAPN,在原核表达系统大肠杆菌中表达并纯化重组脂联素球状区(gAPN)蛋白。用抗APN单克隆抗体MAB10651包被微孔板,10%小牛血清作为封闭液,针对APN不同抗原表位的单克隆抗体MAB1065生物素化后作为标记抗体,联合生物素-亲和素信号放大系统,以gAPN重组蛋白为标准品绘制标准曲线,以准确性、特异性、重复性、回收率试验和方法对比试验评价ELISA方法。检测161例冠心病患者血清APN水平并结合冠状动脉造影结果和Gensini积分系统,探讨血清APN水平与冠心病的关系。结果:利用基因克隆技术成功构建了pET22b(+)/gAPN质粒,获得了相对分子质量约15 000的重组gAPN蛋白,产量较高(1.57 mg),纯度>90%,并以此为标准品初步建立了检测人血清APN的定量ELISA方法。该法具有良好的准确性和重复性,灵敏度达150 pg/ml,回收率为91.0%~108.0%,与深圳依诺金生物科技有限公司进口分装的ELISA试剂盒对照比较有良好的相关性(r=0.935,P<0.001)。临床检测表明冠心病组血清APN水平明显低于非冠心病组(P<0.01),且血清APN水平随冠状动脉狭窄程度的加重呈进行性下降趋势。结论:本实验成功建立了一种简便快速检测人血清APN的ELISA方法,对诊断冠心病有临床应用价值,为国内APN诊断试剂盒的研制和开发提供了科学实验依据。     

抗H5N1禽流感病毒VHH抗体库的构建

目的:构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链可变区抗体库(VHH型抗体库),为抗H5N1的VHH抗体筛选奠定基础。方法:利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼,一定免疫时间后测定小羊驼外周血清中抗体中和活性,分离其外周淋巴细胞,利用RT-PCR方法得到VHH抗体片段。通过优化连接和电转化方法,将足量VHH片段与pCANTAB5E连接后电转入大肠杆菌TG1,获得VHH抗体基因库;检测基因库库容以及多样性,并采用血凝抑制试验对噬菌体抗体库进行初步功能性鉴定。结果:利用H5N1灭活疫苗免疫小羊驼四次后,其外周血清中抗体血清抑制效价可达1∶2 560,构建的VHH抗体基因库库容可达3×108,随机挑选14个抗体基因克隆进行测序鉴定,结果显示均为独立克隆,表明所建抗体库多样性好。上述基因库经辅助噬菌体拯救后,得到抗H5N1的噬菌体VHH型抗体初级库,对初级库进行血凝抑制试验,结果呈阳性,表明初级库中存在具有潜在中和活性的抗H5N1抗体。结论:结果表明,已成功构建抗H5N1禽流感病毒的小羊驼免疫噬菌体重链抗体库,为进一步筛选抗H5N1禽流感的重链抗体打下良好基础,并为H5N1的早期临床诊断和治疗提供新的手段。     

Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的 利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区(DENV-1～4EDⅢ),获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ.方法 PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因,构建至pPIC9K毕赤酵母表达质粒.酶切线性化后电转化毕赤酵母菌GS115,涂板后经G418梯度浓度筛选,获得多株抗G418 4.0 mg/ml的高拷贝菌株,扩大培养后,利用甲醇诱导分泌表达重组蛋白,表达上清用Ni-NTA亲和树脂纯化后以免疫印迹鉴定.结果 成功构建pPIC9K-DENV-1～4 EDⅢ重组质粒,高拷贝菌株经甲醇诱导后分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ重组蛋白,纯化后获得的可溶性重组蛋白经变性凝胶电泳,相对分子质量约为12×103,与实际相符.免疫印迹鉴定结果表明该重组蛋白能与抗His单抗和抗Ⅰ～Ⅳ型DENV小鼠血清特异结合.结论 成功通过毕赤酵母高效分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ蛋白,这些重组蛋白可进一步用于疫苗、诊断试剂和E蛋白生物学功能的研究.     

利用Agilent 定制基因芯片筛选相同病理类型、不同预后的早期乳腺癌的分子标记物

目的分析相同病理类型、临床分期（Ⅰ~Ⅱ期）但预后不同的乳腺癌组织的基因表达差异,筛选出有意义的基因组合,寻找
与乳腺癌预后相关的基因,探索可以早期预测乳腺癌预后的基因分型诊断标准。方法用Agilent定制人8×15 000芯片对筛选
出的实验组8例早期乳腺癌患者的组织标本,结合其预后数据,进行差异基因表达分析;采用Real-time PCR技术,在同期收集的
验证组42例乳腺癌样本中对差异表达的基因进行验证。结果基因芯片检测分析发现,实验组预后差样本比预后好样本有差
异表达基因132个,其中44条基因显著上调,88条基因显著下调（差异均在2倍以上）。结论相同病理类型、临床分期、不同预
后的早期乳腺癌组织中基因表达存在显著差异,CD44、MKI67、NTRK2、Nek2、C16orf60、TOP2A、ANCCA、RRM2等8个基因可
以作为早期乳腺癌预后预测基因标记物。
     

超敏C反应蛋白、脂蛋白（α）和脂联素集成检测诊断冠心病的价值

目的探讨超敏C反应蛋白（hs-CRP）、脂蛋白（α）[Lp（α）]和脂联素联合检测对冠心病的诊断价值。方法对161例疑诊冠心病的患者进行冠状动脉造影检查,根据造影结果分为冠心病组和非冠心病组,收集5 ml无抗凝全血标本,分离血清,利用悬浮芯片同时检测同一标本hs-CRP、Lp（α）和脂联素3个指标。结果冠心病组hs-CRP、Lp（α）测定值均显著高于非冠心病组（P<0.01）,而冠心病组脂联素测定值显著低于非冠心病组（P<0.01）;3个指标集成检测进行平行试验分析时灵敏度（90%）显著高于单个标志物检测的灵敏度[hs-CRP 65%、Lp（α）74%、脂联素58%,P<0.01],进行系列试验分析时特异度（92%）显著高于单个标志物检测的特异度（hs-CRP85%、Lp（α）69%、脂联素75%,P<0.01）。结论集成检测hs-CRP、Lp（α）和脂联素能更准确诊断冠心病,有效的减少漏诊与误诊。