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目的: 评价基于基因芯片的miRNA表达差异在结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)与病毒性脑膜炎(viral meningitis,VM)诊断中的价值。方法: 选取2017年12月至2019年9月在首都医科大学附属北京胸科医院和首都医科大学附属北京天坛医院治疗的TBM患者28例和VM患者27例作为验证样本进行实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证。选取前期收集的8例TBM患者和5例VM患者作为基因芯片样本进行全基因组miRNA微阵列分析,通过预测差异性miRNA的靶基因、基因本体(GO)富集分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析、构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络筛选出两病间前10个差异性miRNA枢纽基因。再采用qRT-PCR对患者间表达差异明显的miR-21-5p进行验证,并通过受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)分析miRNA的诊断价值。结果: 通过miRNA微阵列分析初步筛选出26个差异表达的miRNA(14个表达上调,12个表达下调)和对应的靶基因3217个。经GO富集分析、KEGG信号通路分析筛选出190个相关靶基因,对其进行PPI网络分析,筛选出前10个靶基因作为核心靶基因。对基因芯片检测样本的hsa-miR-21-5p相对表达量进行qRT-PCR验证,发现TBM患者hsa-miR-21-5p的表达水平[15.890(3.423,25.581)]较VM患者[0.807(0.614,0.955)]明显上调(Z=-2.355,P=0.019),差异倍数(TBM/VM)在基因芯片和qRT-PCR中分别是4.817和4.660,两种检测方法结果基本一致;对28例TBM和27例VM患者的hsa-miR-21-5p进行qRT-PCR结果比较,发现hsa-miR-21-5p在TBM患者的相对表达量为4.825(2.433,21.362),明显高于VM患者[0.204(0.112,0.711)],差异有统计学意义(Z=-5.000,P=0.000),且ROC曲线区分TBM与VM患者的AUC为0.893(0.806~0.980),敏感度为85.7%,特异度为88.9%。结论: 相较于VM患者,作为基因芯片检测中表达差异明显的miR-21-5p在TBM患者中表达明显上调,可作为鉴别TBM与VM的潜在生物标志物。 相似文献
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目的筛选鉴定有助于结核性胸膜炎分子生物学检测的胸腔积液核酸提取方法。方法收集18例结核性胸膜炎患者胸腔积液样本,分别采用6种方法提取核酸,应用微滴数字PCR技术分析样本中结核分枝杆菌特异性核酸IS6110和IS1081数量,以此评估不同胸腔积液核酸提取方法的优劣。结果对于胸腔积液原液或胸腔积液离心上清,采用柱法和磁珠法提取的核酸样本中靶标数量无明显差别。对于胸腔积液离心沉渣,采用物理破碎法提取的核酸样本中IS6110和IS1081数量显著高于化学破碎法(IS6110,Z=-3.408,P=0.001;IS1081,Z=-3.297,P=0.001)。相比于小体积(0.7 mL)胸腔积液原液直接提取,大体积(4 mL)胸腔积液离心的上清和沉渣(物理破碎)中提取的核酸样本含有更多的靶标数量(分别IS6110,Z=-3.237,P=0.001,IS1081,Z=-2.667,P=0.008;IS6110,Z=-3.157,P=0.002,IS1081,Z=-2.250,P=0.024)。结论大体积胸腔积液离心上清游离核酸提取法和离心沉渣物理破碎核酸提取法能够富集更多的结核分枝杆菌核酸,是较好的用于结核性胸膜炎分子生物学检测的核酸制备方法。 相似文献
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目的 建立胸腔积液结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)复苏因子薄层琼脂(Rpfs-TLA)快速培养法并评估其临床应用价值。方法 收集2016年7月至2018年11月北京胸科医院103例结核性胸膜炎和34例其他胸膜疾病患者的胸腔积液,经过离心、消化处理后进行M.tb复苏因子薄层琼脂和普通薄层琼脂培养,比较Rpfs-TLA与普通TLA培养M.tb的阳性率、平均报阳时间、菌落形成单位数的组间差异。结果 胸腔积液Rpfs-TLA培养组和普通TLA对照组M.tb的阳性率分别为43.7%和29.1%,差异有统计学意义(χ2=54.56,P<0.001)。Rpfs-TLA培养显微镜下微菌落与肉眼可视菌落平均报告时间为11.87 d和18.13 d,差异有统计学意义(t=31.82,P<0.001)。Rpfs-TLA与普通TLA培养显微镜下微菌落的平均报告时间为11.87 d 和20.60 d,差异有统计学意义(t=16.62,P<0.001)。Rpfs-TLA诊断结核性胸膜炎的灵敏度为43.7%,特异度为100%,准确度为57.7%。结论 Rpfs-TLA 是一种准确、快速、廉价且易于培养的方法,可为结核性胸膜炎诊断提供帮助。 相似文献
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目的 探讨评价结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)对淋巴结结核的辅助诊断价值.方法 本研究募集北京胸科医院2011年7月至2013年12月收治住院的淋巴结肿大患者185例,最终分为确诊结核性淋巴结组(51例)、非结核性淋巴结疾病组(105例),其余诊断不明确或临床诊断淋巴结结核患者予以剔除.所有患者均行外周血T-SPOT.TB及免疫印迹法检测结核分枝杆菌抗体.采用SPSS 17.0进行统计学分析,非正态分布的计量资料数据用中位数(上下四分位数)[M(P25,P75)]表示,两组间斑点形成个数(SFCs)数据比较采用Mann WhitneyU检验,组间样本率的比较采用x2检验,以P<0.05为差异具有统计学意义.结果 T-SPOT.TB和免疫印迹法检测结核分枝杆菌抗体的敏感度分别为92.2%(47/51)和60.8%(31/51),特异度分别为79.0%(83/105)和77.1%(81/105),T-SPOT.TB敏感度显著高于免疫印迹法检测结核分枝杆菌抗体方法,差异有统计学意义(x2=13.95,P<0.01).结核分枝杆菌特异抗原刺激下结核性淋巴结组SFCs中位数为242个(57,621个)/106外周血单个核细胞(PBMCs),非结核性淋巴结疾病组SFCs中位数为0个(0,20个)/106 PBMCs,结核性淋巴结组SFCs数量显著高于非结核性淋巴结疾病组,应用Mann Whitney U检验,两组间差异具有统计学意义(U=472.0,P<0.01).在T-SPOT.TB结果阳性的69例患者中,47例结核性淋巴结患者SFCs的M(P25,P75)为280个(98,684个)/106 PBMCs,显著高于对照组22例非结核性淋巴结疾病患者SFCs的M(P25,P75)52个(35,93个)/106 PBMCs(U=146.5,P<0.01).结论 T-SPOT.TB方法在淋巴结结核的诊断中有着较高的敏感度,有可能成为淋巴结结核辅助诊断的一项重要手段. 相似文献
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目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中RASSF1A启动子的甲基化状态及临床意义.方法 采用甲基化特异的PCR(MSP)检测150例NSCLC、34例癌旁正常组织和20例肺部良性病变中RASSF1A启动子甲基化状态.结果 150例NSCLC中58例发现RASSF1A启动子存在甲基化(38.7%),34例癌旁正常组织和20例肺部良性病变无一例发现RASSF1A启动子甲基化.RASSF1A启动子甲基化与年龄、性别、吸烟指数、组织类型、TNM临床分期均无关(P>0.05),与开始吸烟年龄、肿瘤分化程度相关(P<0.05).结论 RASSF1A启动子甲基化状态可以作为NSCLC诊断的一个候选分子标志. 相似文献
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目的 采用噬菌体与硝酸盐还原实验结合的技术,以期建立一种新的快速、简易、廉价的结核杆菌药敏检测方法.方法 对49株结核杆菌的临床分离株以噬菌体硝酸盐还原实验(PhaB-NRA法)与改良罗氏绝对浓度法对结核杆菌进行利福平、异烟肼药物敏感性测定,以绝对浓度法作为参照标准判定PhaB-NRA法的敏感性、特异性、准确性及其可行性.结果 PhaB-NRA法对利福平进行药物敏感性测定的敏感性、特异性、准确性分别为89.1%、91.67%、89.8%;对异烟肼进行药物敏感性测定的敏感性、特异性、准确性分别为86.21%、90.0%、87.8%.它们与绝对浓度法的符合率分别为利福平:0.746;异烟肼:0.750.结论 PhaB-NRA法简化了实验步骤、缩短了药敏检测时间,且无需昂贵的仪器,有望成为快速结核杆菌药物敏感性测定的初筛方法. 相似文献
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目的构建结核分枝杆菌复苏因子D基因(RpfD)真核表达载体,为结核分枝杆菌复苏因子DNA疫苗的研究奠定基础。方法 PCR扩增复苏因子D基因片段,克隆至PcDNA3.1(-)载体中,重组质粒测序正确后,转染至CHO细胞中。通过G418筛选,RT-PCR检测克隆基因mRNA在真核细胞的表达,Westernblot检测目的蛋白的表达。结果构建了PcDNA-RpfD表达载体,RT-PCR证实构建的载体能在CHO细胞中表达RpfD基因mRNA,Western blot证实转染了载体的CHO能表达RpfD蛋白质。结论成功构建PcDNA-RpfD真核表达载体,转染细胞CHO能表达RpfD蛋白质。 相似文献
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目的 构建结核分枝杆菌rv1837c、rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性.方法 PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv rv1837c、rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体.然后转化入表达宿主大肠杆菌B121(DE3),经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导;分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白.经镍离子螫和氮川乙酸-组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,取兔血清与纯化蛋白通过Western blot方法,检测家兔血清中的抗体.结果 pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38 000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30%及50%.获得纯度为90%的重组蛋白.纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的 蛋白,有较强的免疫原性.结论 成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础. 相似文献
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目的:探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)乙酰转移酶fadA3对宿主蛋白乙酰化修饰、基因表达和MTB在体内存活的影响。方法:从首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所分子生物学实验室选取MTB标准株(H37Rv),利用CRISPR-cas系统辅助的非同源性末端接合技术(CRISPR-NHEJ)构建H37Rv-fadA3基因敲除株(ΔfadA3),利用微孔板法分别检测H37Rv和ΔfadA3在7H9液体培养基中的吸光度值(A值)和细菌活性,绘制生长曲线图和最低抑菌浓度表。运用免疫印迹和转录组学测序分析H37Rv和ΔfadA3感染巨噬细胞(巨噬细胞系THP-1分化得到)后蛋白质乙酰化修饰变化及基因表达的差异情况;采用菌落计数和苏木精-伊红染色法分析H37Rv和ΔfadA3在C57BL/6J小鼠肺组织和巨噬细胞中的存活及病理变化。结果:fadA3经敲除1116 bp片段后成功获得ΔfadA3敲除株。H37Rv和ΔfadA3在培养第3、6、9和12天的A600值(分别为0.245±0.005和0.232±0.01... 相似文献
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目的筛选结核杆菌在人体内诱导表达的基因,进而作为候选的免疫及药物分子新靶位。方法构建结核杆菌基因组表达文库,应用体内诱导的抗原技术,用吸收过的结核患者血清筛选文库,对阳性克隆测序得到开放阅读框(ORF)。结果实验共确定r51个ORF。按照功能分为8类:毒力、解毒及调节相关基因1个,细胞壁与细胞处理相关基因13个,中间代谢和呼吸相关基因11个,脂类代谢基因7个,信号通路基泪2个,PE/PPE蛋白家族基因3个,保守假设蛋白基因12个,与牛型分枝杆菌同源的保守假设蛋白基因2个。结论应用体内诱导抗原技术可以筛选到结核杆菌进入人体后诱导表达的基因,其中部分基因可以作为结核病预防、诊断和治疗研究的候选靶位。 相似文献