Netrin-1促进肝癌细胞HepG2抗失巢凋亡的作用

目的 初步探讨神经生长因子Netrin-1对人肝癌细胞HepG2抗失巢凋亡的作用及相关机制.方法 采用脂质体转染的方法,将Netrin-1的真核表达质粒转染到肝癌细胞HepG2中,Western blot检测Netrin-1的表达;用软琼脂集落试验、悬浮培养模型及流式细胞检测的方法观察肝癌细胞HepG2抗失巢凋亡的特性.结果 肝癌细胞HepG2在失巢状态下可以聚集成团生长,并与贴壁生长有相似的凋亡比例.与对照组细胞相比,稳定转染Netrin-1真核质粒的HepG2细胞在软琼脂中形成细胞集落的数量明显增加,在悬浮培养模型中形成细胞团的直径更大,在失粘附状态下的细胞凋亡比例明显降低;磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路的抑制剂LY294002能增加转染细胞在失粘附状态下的凋亡比例.结论 肝癌细胞HepG2具有抗失巢凋亡的特性,Netrin-1可以增强HepG2细胞抗失巢凋亡的能力,其机制可能与PI3-K通路相关.     

过表达连接蛋白32对人肝癌细胞株MHCC-97H体外侵袭能力的影响

目的 探讨过表达连接蛋白32(Cx32)对人肝癌细胞株MHCC-97H体外侵袭能力的影响.方法 应用Lipofectamine 2000将pcDNA 3.1(-)/Cx32重组质粒转染至MHCC-97H细胞,G418稳定筛选.采用Western blot法检测Cx32蛋白表达,划痕标记荧光传输实验显示细胞通讯功能的变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力的改变.结果 转染pcDNA 3.1(-)/Cx32重组质粒使得MHCC-97H细胞过表达Cx32蛋白.与正常对照组和转染空质粒组细胞相比,转染pcDNA 3.1(-)/Cx32重组质粒并过表达Cx32的细胞胞间通讯功能增强,细胞侵袭能力减弱.结论 Cx32在人原发性肝癌的侵袭过程中可能起抑制作用.     

过表达SATB1对人原发性肝癌细胞HepG2增殖的促进作用

目的研究核基质结合蛋白SATB1对人原发性肝癌HepG2细胞增殖的影响。方法脂质体介导pEGFP1 SATB1真核表达全长基因质粒转染人原发性肝癌HepG2细胞,分为实验组（pEGFP1 SATB1）、对照组（pEGFP1空载体）及空白对照组。RT PCR、Western blot检测转染后SATB1mRNA和蛋白表达变化情况,噻唑蓝（MTT）法、流式细胞仪检测SATB1全长基因转染对人原发性肝癌HepG2细胞生长、增殖的影响。结果与空白对照组及对照组比较,转染pEGFP1 SATB1后,HepG2中SATB1mRNA和蛋白表达明显增加,细胞生长曲线检测结果表明转导入pEGFP1 SATB1细胞增殖明显加快,细胞数明显增多;流式细胞仪检测结果表明,细胞周期中G0/G1期细胞明显减少,S、G2/M期细胞明显增多。结论SATB1能明显促进HepG2细胞增殖,其机制可能与参与调控细胞周期各期DNA复制、转录有关。     

β2-spectrin的siRNA对AML-12肝细胞增殖特性的影响

目的 应用特异性siRNA干扰小鼠肝细胞株AML-12中β2-spectrin表达,检测AML-12细胞增殖凋亡以及细胞周期的改变.方法 化学合成β2-spectrin特异性siRNA,分别转染AML-12细胞,荧光定量PCR和Western blot 确定其抑制效果.AML-12细胞经TGF-β细胞因子处理4 h后,转染β2-spectrin特异性siRNA,48 h后,BrdU标记法以及流式细胞术检测β2-spectrin沉默前后AML-12细胞增殖、凋亡以及周期变化;共聚焦技术检测干扰β2-spectrin表达对TGF-β/Smad信号通路中Smad3、Smad4核定位的影响.结果 siRNA可以高效特异沉默β2-spectrin 的表达.流式细胞术检测显示,β2-spectrin沉默促进AML-12细胞增殖,抑制凋亡,S期细胞比例显著升高.免疫荧光结果 显示,TGF-β处理后,Smad3、Smad4表达定位于细胞核,沉默β2-spectrin干扰Smad3、Smad4细胞核内定位.结论 沉默β2-spectrin的表达促进AML-12增殖,抑制凋亡,促进细胞向S期转化.其机制可能是通过干扰Smad3、Smad4核定位而抑制TGF-β/Smad信号通路,进而发挥诱导凋亡效应.     

靶向MTDH的小干扰RNA对人原发性肝癌细胞HepG2骨架重排的影响

目的构建人MTDH基因的shRNA干扰载体,并观察其对原发性肝癌细胞HepG2骨架重排的影响。方法针对MTDH基因的不同部位设计3对shRNA的寡核苷酸片段,克隆到载体pGCsilencerTM H1/Neo中,RT-PCR、Western blotting及免疫荧光检测转染后MTDH mRNA和蛋白表达变化情况,并筛选最佳抑制效率的shRNA干扰载体,并将其转染人原发性肝癌细胞HepG2,用罗丹明标记的鬼笔环肽显示沉默MTDH基因后对人原发性肝癌细胞HepG2骨架蛋白F_actin的改变。结果靶向MTDH干扰质粒构建成功。与转空载体的阴性对照组及未转染组比较,转染pGCsilencerTM H1/Neo-MTDH-shRNA后,HepG2中MTDH mRNA和蛋白表达明显降低,其中以pGCsilencerTM H1/Neo-MTDH-S1最为明显,达到90%以上;细胞形态及细胞骨架显示转染pGCsilencerTMH1/Neo-MTDH-S1的细胞骨架蛋白F_actin发生重排。结论成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向MTDH干扰pGCsilencerTM H1/Neo-MTDH-S1,该载体能有效重排肝癌细胞骨架。     

肿瘤坏死因子α对人肝癌细胞株SMMC-7721体外侵袭能力的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对人肝癌细胞株SMMC-7721体外侵袭能力的影响及其相关机制. 方法不同浓度TNF-α作用于人肝癌细胞株SMMC-7721后,采用Transwell试验检测细胞侵袭能力的改变,采用划痕标记荧光传输试验显示缝隙连接细胞通讯功能的变化,采用Western blot法检测连接蛋白32(Cx32)在细胞膜的表达. 结果 不同浓度TNF-α作用于人肝癌细胞株SMMC-7721后,Transwell试验显示细胞侵袭能力较对照组提高,且随TNF-α浓度增加而升高. 同时,缝隙连接细胞通讯功能减弱,细胞膜上Cx32的表达减少. 结论 TNF-α可能通过影响Cx32在细胞膜的表达及细胞通讯促进人肝癌细胞株SMMC-7721的侵袭能力.