左归丸对同种异性骨髓移植小鼠肝再生相关基因信号通路的影响

背景:维持正常的肝再生足避免肝纤维化和肝癌发生发展的关键环节,中医药调控肝再生主要反映在单味或复方中药对肝细胞、间质细胞、骨髓干细胞的增殖调控.目的:利用基因芯片技术探讨中药左归丸对同种异性骨髓移植小鼠肝再生相关基因信号通路的影响.设计、时间及地点:开放件实验,于2002-01/2007-12在湖北中医学院附属医院肝病研究所完成.材料:SPF级4周龄BABL/C小鼠,雄性10只,作为供体;雌性80只,作为受体,随机分为单纯骨髓移植组、左归丸治疗组,40只/组.小鼠16K v1.0基因表达谱寡核苷酸芯片由上海生物芯片公司提供.芹归丸由熟地、淮山药、枸杞子、山茱萸、菟丝了、川牛膝、鹿角胶、龟板胶组成.方法:两组受体小鼠接受60Co源γ射线照射后,经尾静脉输入供鼠单个核细胞悬液0.2 mL(约2×106个细胞),移植后分别给予生理盐水、左归丸7g/(kg·d)灌胃,6个月后取肝组织标本.选用小鼠基因表达谱寡核苷酸芯片,提取液氮冻存肝组织总RNA,利用反转录酶合成掺有荧光标记的cDNA探针,将探针与基因表达谱芯片杂交,筛选样奉之间杂交信号比值有差异表达的基因.利用GenBank ID和UniGene数据库将差异表达基因聚类,按基因本体分类法对聚类的差异表达基因分类,并采用KEGG数据库查询差异表达基因所涉及的信号通路.主要观察指标:差异表达基因谱.与肝再生相关的代谢及信号通路.结果:①与单纯骨髓移植组相比,左归丸治疗组差异表达基因共1 147条,已知功能基因有533条,其中209条基因涉及70种生物化学通路.②在差异表达基因涉及的代谢信号通路中,与肝再生相关的信号通路主要有Wnt信号通路、MAPK信号通路、TGF β信号通路、Jak-STAT信号通路、凋亡、Toll样受体信号通路等,这些通路中Wnt1、EGF、FGF2、FGF16、MAPKK1、E2F、CSF3、Myd88、sFRP1、sFRP5、CSF2受体、CNTF受体、Caspase 12等基因表达上调,MAPK9、Rac1、GSK3、Wnt10a、IL12a、蛋白激酶C γ、Akt2、Activin A受体等基因表达下调.结论:左归丸调控肝再生的作用机制可能在于网络式双向调控肝再生相关信号通路中的基因表达.     

移植雄性骨髓的雌性小鼠肝组织肝再生相关基因的信号通路

目的:探讨骨髓形成肝细胞的分子机制.方法:采用移植♂骨髓的♀小鼠模型,♀Balb/c小鼠随机分为模型组和正常对照组,选用小鼠基因表达谱寡核苷酸芯片,利用反转录酶合成掺有荧光标记的cDNA探针,将探针与基因表达谱芯片杂交观察小鼠肝组织基因表达谱的变化,筛选样本之间杂交信号比值有差异表达的基因.采用生物信息学方法分析模型组中小鼠肝组织再生相关基因的信号通路变化规律.结果:♀小鼠在移植♂骨髓6 mo后肝组织的基因表达谱显著不同,对照组相对于正常组的差异表达基因有865条,已知功能基因有447条,其中上调基因92条,下调基因355条.与肝再生相关基因信号通路涉及HGF,TGF-β,Focal Adhesion,JAK-Stat,VEGF等信号通路,他们相关基因的上调表达促进肝细胞的增殖分化.TGF-β信号通路中相关基因下调,抑制信号通路的激活,减弱肝再生的负性作用,利于肝细胞的增殖分化.结论:♀小鼠移植♂骨髓后的肝组织基因表达谱显著变化,有可能通过其肝再生相关基因的信号通路激活或抑制调节肝再生.     

不稳定型心绞痛患者循环microRNA对神经生长因子通路的靶向调节作用及其功能调控网络

目的:研究不稳定型心绞痛患者循环microRNA表达谱变化,及其通过神经生长信号通路的网络调控作用.方法:选取冠状动脉造影阴性的患者作为对照(n=6)和不稳定型心绞痛患者(n=6),抽取静脉血,提取全血microRNA,利用Taqman低密度微小RNA芯片检测microRNA表达,通过芯片数据分析工具SAM(significance analysis of microarray)得出显著差异表达microRNA.应用预测工具(Targetscan,miRanda,DIANA-microT)得出不稳定型心绞痛相关microRNA的靶基因,应用芯片整合生物信息分析工具DAVID分析相关靶基因富集的信号通路,利用Panther数据库获取靶基因的生物功能聚类,通过Cytoscape构建microRNA的靶基因功能网络.结果:不稳定型心绞痛患者循环血中显著上调了20个microRNAs,并且其主要靶向调节神经生长因子通路,靶基因的功能集中在信号传导、细胞增殖分化、细胞周期、免疫炎症、神经生长和活动、细胞凋亡.结论:差异表达上调的microRNA主要抑制调节神经生长因子通路,即抑制细胞增殖、免疫炎症、神经生长等,从而稳定动脉粥样硬化易损斑块.     

左归丸药物血清对骨髓间质细胞转化为肝细胞的作用

目的:一些实验已证实骨髓干细胞可以向肝细胞横向分化,观察补肾中药左归丸含药血清对骨髓间质细胞分化为肝细胞的影响。方法:实验于2002-01/2004-12在湖北中医学院附属医院肝病研究所完成。①实验动物:选取SPF级纯系Wistar大鼠46只,1只用于骨髓间质细胞的分离及培养,剩余45只用于含药血清的制备。另取2d龄Wistar乳鼠20只,用于肝脏细胞的培养。②实验方法:以体外肝细胞培养上清为诱导条件培养液,采用贴壁分离法纯化大鼠骨髓间质细胞。45只Wistar大鼠依次取15只用生理盐水、中药左归丸(由熟地、淮山药、枸杞子、山茱萸、菟丝子、川牛膝、鹿角胶、龟版胶组成)浓缩煎剂、中药八珍汤(由人参10g,白术10g,茯苓10g,甘草6g,当归15g,川芎10g,白芍15g,熟地15g组成)浓缩煎剂按10mL/kg灌胃,灌胃量以生药10g/kg计算,1次/d。第15天灌胃后2h,腹腔麻醉颈动脉插管取血,分管盛装含药血清,放置备用。大鼠骨髓间质细胞传至6代,分6组诱导培养:常规培养组使用常规培养液(DMEM培养液 体积分数为0.2的胎牛血清 2mmol/L谷氨酸胺)进行培养;肝细胞生长因子诱导组以常规培养液 25μg/L肝细胞生长因子 10-7mol/L地塞米松进行培养;肝细胞生长因子加左归丸组以常规培养液 25μg/L肝细胞生长因子 10-7mol/L地塞米松 10%左归丸含药血清进行培养;条件培养液加对照血清组以常规培养液 50%条件培养液 10%正常大鼠血清进行培养;条件培养液加八珍汤组以常规培养液 50%条件培养液 10%八珍汤含药血清进行培养;条件培养液加左归丸组以常规培养液 50%条件培养液 10%左归丸含药血清进行培养。③实验评估:诱导28d,每组10个复孔,分别于诱导第0,7,14,21,28天免疫细胞化学法检测肝细胞标志物甲胎蛋白、细胞角蛋白18及白蛋白阳性细胞率,PAS染色检测糖原阳性细胞率。结果:①诱导第0天,各组甲胎蛋白、白蛋白阳性细胞呈极少数表达(t=0.44～1.90,P>0.05),细胞角蛋白18及糖原均未见阳性细胞表达。②肝细胞生长因子加左归丸组、条件培养液加左归丸组在诱导第7,14,21,28天白蛋白、细胞角蛋白18、糖原的阳性细胞率均显著高于其他4组(t=5.42～55.00,P<0.05);甲胎蛋白阳性细胞率于诱导第7天时增高显著(t=55.00,P<0.05),此外各时间点又明显降低。③与肝细胞生长因子加左归丸组比较,条件培养液加左归丸组白蛋白阳性细胞率在诱导第14,21,28天时显著升高(t=4.06～7.49,P<0.05);甲胎蛋白阳性细胞率在诱导第7天时显著升高(t=83.69,P<0.05),至诱导第14,21,28天则明显下降(t=55.53～83.00,P<0.05)。结论:左归丸含药血清能够影响骨髓间质细胞向肝系细胞转化过程中的肝细胞标志物,从而提高骨髓间质细胞向肝细胞的转化率。     

左归丸促进骨髓形成肝细胞的研究

目的:观察补肾(左归丸)对小鼠骨髓形成肝细胞的影响,揭示"肾生骨髓,髓生肝"的科学内涵.方法:采用交叉性别骨髓移植模型,雌性BALB/c小鼠随机分为补肾组(左归丸)、补气血组(八珍汤)和对照组(生理盐水),接受9.0Gy60Co源γ射线照射后,经尾静脉注射输入同种系雄性小鼠骨髓细胞,骨髓移植后分别给予7g/(kg?d)左归丸、八珍汤、生理盐水灌胃,给药2、4、6mo处死动物,取肝组织标本.通过荧光原位杂交检测肝组织切片雄性性别决定基因Sry与白蛋白mRNA双阳性细胞(雄性骨髓来源的肝细胞),计算各组骨髓转化为肝细胞的阳性细胞率(%).结果:补肾组、补气血组和对照组的阳性细胞率均随着骨髓移植时间的延长而增加,移植后6mo时间点骨髓转化为肝细胞的阳性细胞率(18.25±3.36)与2、4mo时间点(4.00±1.73,4.80±1.30)相比显著升高(P<0.01).同一时间点不同组小鼠骨髓转化为肝细胞的阳性细胞率有显著差异,骨髓移植后2mo时补肾组阳性细胞率(4.00±1.73)高于补气血组(1.20±0.45)和对照组(1.00±0.61)(P<0.01),移植后4mo时补肾组阳性细胞率(4.80±1.30)高于补气血组(1.40±0.55)(P<0.01),移植后6mo时补肾组阳性细胞率(18.25±3.36)高于补气血组(7.20±1.33)和对照组(9.25±1.31)(P<0.01).结论:补肾(左归丸)能够促进骨髓形成肝细胞.补肾促进骨髓形成肝细胞的作用机制可能在于调节全身机能和改善肝脏微环境,有利于骨髓细胞移行至肝脏并转化为肝细胞.     

不稳定冠心病循环microRNA表达谱特点及功能分析

目的 明确不稳定冠心病患者循环microRNA（miRNA）表达谱,并对差异表达miRNA在细胞增殖中的调控作用进行探讨。方法 （1）分别收集不稳定冠心病患者（试验组）及疑似心绞痛的非冠心病患者（对照组）血浆,通过miRNA芯片检测,得到试验组患者循环miRNA表达谱。（2）分别在3个不同的生物信息学数据库——TargetScan、miRanda和DIANAmT,对miRNA靶基因进行预测,得到在3个数据库均有预测的miRNA靶基因。（3）通过DAVID数据库,对上述靶基因在细胞增殖方面的功能进行聚类及信号通路分析。（4）通过实时（real time,RT）-PCR实验,进一步验证循环miRNA-19b（miR-19b）在两组中的表达水平。（5）结合功能聚类分析结果,对差异表达最明显的（miR-19b）在细胞增殖中的调控作用进行验证。结果 （1）与对照组相比,试验组存在39个差异表达miRNAs,其中miR-19b差异表达最明显。（2）通过对miRNA靶基因的预测,发现有14个miRNAs与细胞增殖关系密切,其中miR-19b调控的细胞增殖相关基因最多。（3）RT-PCR检测证实不稳定冠心病患者血浆miR-19b水平较对照组明显增高。（4）细胞增殖实验表明,miR-19b明显抑制血管内皮细胞（EA.hy926细胞）增殖。结论 不稳定冠心病患者具有特定的循环miRNA表达谱,这些miRNAs可能是不稳定冠心病的潜在生物标志物。miR-19b可能通过抑制内皮细胞增殖,发挥稳定动脉粥样硬化斑块的保护作用。     

冠心病合并脑血管狭窄与血浆氧化三甲胺水平的关系

目的:探讨冠心病合并脑血管狭窄与血浆氧化三甲胺(TMAO)的关系。方法:回顾性分析了2013年10月至2016年6月于首都医科大学附属北京天坛医院心内科就诊的158例住院患者。患者均在住院期间接受了冠状动脉造影及全脑血管造影,并依据检查结果分为:对照组(无冠心病及脑血管狭窄病变,n=20)、冠心病组(n=25)、脑血管狭窄组(n=17)和冠心病合并脑血管狭窄组(n=96)。检测并比较各组空腹血浆TMAO及其前体物质左旋肉碱、胆碱、甜菜碱等水平,分别比较冠心病组、冠心病合并脑血管狭窄组Gensini评分与TMAO的相关性。结果:冠心病组与冠心病合并脑血管狭窄组中位TMAO水平分别为7.15(3.77,16.75)μmol、8.13(4.87,17.38)μmol,均明显高于对照组的3.22(2.19,9.00)μmol,P均<0.001;将各组TAMO水平经自然对数转化为正态分布后比较显示,冠心病组与冠心病合并脑血管狭窄组仍高于对照组(P均<0.01),也高于脑血管狭窄组(P均<0.05),不过冠心病组与冠心病合并脑血管狭窄组差异未见统计学意义(P=0.682);脑血管狭窄组与对照组差异未见统计学意义(P=0.582)。各组间左旋肉碱、胆碱、甜菜碱血浆水平差异未见统计学意义(P>0.05)。在冠心病组,TMAO水平与Gensini评分正相关(r=0.569,P=0.009),左旋肉碱水平与Gensini评分负相关(r=-0.700,P=0.001),胆碱、甜菜碱水平与Gensini评分未见明显相关;在冠心病合并脑血管狭窄组,TMAO、左旋肉碱、胆碱、甜菜碱血浆水平均未见与Gensini评分明显相关。结论:冠心病合并脑血管狭窄与血浆TMAO水平升高无关。     

从昼夜规律对肝脏凝血系统的影响探讨子午流注的基因背景

<正>子午流注源于中医针灸“人与天地相应”的观点，依据人体功能活动、病理变化受自然界气候变化等影响规律辨证循经按时取穴的针灸治疗方法，后来发展成为中医药因时制宜(“因时施治”“因时针灸”“因时给药”)的理论基础，是较早的“时间生物学”“时间治疗学”的思想和实践^[1,2]。肝脏作为最重要的消化腺，其生理功能和相关生物大分子表达、代谢活性有着很明显的昼夜节律性^[3]，已有研究报道昼夜节律对肝脏的糖代谢、脂代谢以及胆汁酸代谢等均起到重要作用^[4,5]。肝脏也是凝血因子的合成器官，对于维持凝血系统功能有重要作用^[6]，但昼夜节律是否影响肝脏凝血系统功能仍有待研究。本研究通过对小鼠肝组织基因表达谱的分析，筛选具有昼夜节律性的凝血功能相关基因，探讨昼夜节律对凝血系统功能的影响，为子午流注的微观生物学背景研究提供思路。