弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)的克隆表达与多克隆抗体制备

目的 制备特异识别弓形虫沉默信号调节子2(TgSir2)多克隆抗体。方法 以酵母Sir2氨基酸序列为模板,寻找弓形虫基因组中同源序列,并进行信号肽预测。以弓形虫RH株cDNA为模板,构建pET28b-TgSir2重组质粒,转化入大肠埃希菌(E. coli)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用镍柱亲和层析法纯化诱导表达产物,并以小鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)进行鉴定。以纯化的TgSir2蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得特异性抗TgSir2多克隆抗体。最后,以此多克隆抗体作为一抗,Western blotting检测与虫体蛋白的反应情况。结果 同源比对找到弓形虫基因组中TgSir2,信号肽分析提示1-15位氨基酸为其信号肽序列。PCR、双酶切及测序结果证实原核表达质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,IPTG可诱导TgSir2融合蛋白的大量表达。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体既能特异性识别原核表达的TgSir2蛋白,也能识别弓形虫体内的内源性TgSir2蛋白。结论 制备的抗重组TgSir2蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫RH株的TgSir2蛋白。     

基因芯片分析弓形虫感染宿主细胞microRNAs差异表达

目的:研究弓形虫感染人包皮成纤维细胞(HFFs)的microRNAs (miRNAs)差异表达.方法:基因芯片分析弓形虫感染的HFFs的miRNAs差异表达,并用实时荧光定量RT-PCR法和Northern blot法验证miRNAs差异表达.结果:弓形虫感染HFFs的46种miRNAs表达量有1倍以上上调,37种miRNAs表达量有1倍以上下调.其中4种差异表达的miRNAs的实时荧光定量RT-PCR法和Northern blot法验证结果与基因芯片分析结果一致.结论:弓形虫感染可导致宿主细胞的miRNAs差异表达,差异表达的miRNAs可能在弓形虫和宿主细胞的相互作用中起调控作用.