两株鼠抗人GL50单克隆抗体的制备及其生物学特性的初步研究

目的　研制鼠抗人GL5 0分子单克隆抗体并对其生物学特性进行初步研究。方法　以天然高表达人GL5 0分子的Daudi细胞为免疫原 ,人GL5 0 L92 9转基因细胞为目的单克隆抗体(McAb)的筛选细胞 ,采用B淋巴细胞杂交瘤技术 ,获得分泌特异性鼠抗人GL5 0分子McAb的杂交瘤细胞株 ;免疫荧光标记和流式细胞术分析McAb识别GL5 0的表达 ;Westernblot检测抗体对特异性细胞膜蛋白的识别 ;台盼蓝 (Trypanblue)染色细胞计数法和MTT法检测McAb对Daudi细胞体外生长的抑制作用 ;3 H TdR法检测抗体对GL5 0 L转基因细胞介导的活化T细胞体外增殖的效应。结果　成功制备 2株分泌特异性抗人GL5 0抗体的杂交瘤细胞株 12B11和 11C4 ;两者皆为IgG2a亚型 ;腹水效价皆在 1∶10 0 0以上 ;12B11、11C4特异性地识别GL5 0分子。 11C4McAb可以明显抑制Daudi细胞在体外的生长 ,并可抑制GL5 0 L转基因细胞介导的活化T淋巴细胞的体外增殖效应。结论　成功获得了 2株特异性鼠抗人GL5 0抗体 ,其中 11C4McAb具有诱导表达GL5 0分子的B淋巴瘤细胞Daudi的体外生长抑制作用 ;在T淋巴细胞体外增殖反应中发挥了重要的调节作用。     

125I标记抗人CD40 mAb 5H6在荷人卵巢癌(HO8910)BALB/c裸鼠体内分布及放射免疫显像

目的研究125I标记抗人CD40单克隆抗体(mAb)5H6同卵巢癌细胞HO8910体外结合的生物学特性以及在荷瘤鼠体内的分布和放射免疫显像.方法氯胺-T法进行mAb 5H6125I标记(125I-5H6),Lindmo法计算125I-5H6的免疫活性分数;细胞结合饱和实验进行Scatchard分析计算解离常数Kd及最大结合位点数Bmax;建立荷人卵巢癌(HO8910)裸鼠模型,分析125I-5H6在体内的分布,并用SPECT进行放射免疫显像.结果mAb 5H6标记率为(85.4±5.2)%,放射化学纯度为(99.2±0.5)%,125I-5H6免疫活性分数为(38.6±5.4)%,与HO8910细胞的亲和力Kd=(0.711±0.06)nmol/L.在荷瘤鼠体内特异性结合HO8910肿瘤,48小时达到高峰,放射免疫显像肿瘤清晰可见.结论125I-5H6同卵巢癌HO8910细胞在体外结合具有很高亲和力,在体内能特异性结合HO8910肿瘤,能获得优质的放射免疫图像.     

一株抗人BLys单克隆抗体的制备及其生物学功能研究

研究以稳定高表达BLys的基因转染细胞L-BLys为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,L-BLys细胞和天然表达BLys的HL60细胞为抗体筛选阳性细胞株,经免疫荧光标记分析反复筛选和以有限稀释法反复克隆化培养。将获得的克隆4F7培养细胞注射入经致敏的小鼠体内,-抽取的腹水经Protein G亲和层析柱纯化。将纯化所得的抗体作用于经BLys分子刺激的扁桃体B细胞,3H-TdR检测细胞的增殖效率。结果获得1株持续、稳定分泌鼠抗人BLys单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该细胞株所分泌的抗体能阻断膜型和可溶性BLys分子对扁桃体B细胞的促增殖作用。对这株单克隆抗体生物学功能的研究表明,这株单抗能特异性识别人BLys分子及阻断膜型和可溶性BLys发挥生物学活性。     

抗人CD86人-鼠嵌合抗体的构建及在CHO细胞的表达

从分泌鼠抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:1D1)中抽提总RNA,采用简并引物,经RT-PCR扩增单抗VH和VL的DNA编码区基因。通过SMART-PCR扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。采用基因重组技术,将单抗VH、VL基因及其相应信号肽序列,与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/1D1。转染293T细胞进行瞬时表达,采用流式细胞术分析,转染上清与L929-CD86基因转染细胞的阳性结合率为97.6%。既而转染CHO细胞,经G418筛选,获取稳定分泌嵌合抗体的基因转染细胞株(CHO-ch1D1)。收集无血清培养基的培养上清,采用Protein G亲和层析柱分离纯化,经Lowr法定量。从上清中获取的嵌合抗体蛋白的得率为3.066 mg/L。经进一步间接免疫荧光及流式细胞术分析,纯化嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞,及Daudi细胞膜型CD86分子的阳性结合率分别为98.5%和95.7%。将嵌合抗体(终浓度为5μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用(P<0.05)。本研究获取的嵌合抗体在CD86分子的基础和应用研究中具有重要的价值。     

重组人可溶性gp130的纯化及生物学活性鉴定

采用转瓶培养可溶性gp130基因转染细胞。运用免疫亲和层析法,将抗人可溶性gp130的单克隆抗体偶联于CNBr活化的Sepharose 4B。收获基因转染细胞的培养上清,经抗gp130单抗/Sepharose 4B亲和层析柱吸附,用pH 2.8、0.1 mol/L甘氨酸溶液洗脱,获取可溶性gp130重组蛋白纯品。基因转染细胞培养上清中可溶性gp130的表达量为100~120μg/ml,纯化后的回收率为70%~75%,SDS-PAGE电泳后出现一条蛋白曲带。经Western blot分析,纯化的可溶性gp130能与特异性抗体结合。将可溶性gp130(终浓度为5μg/ml)与IL-6依赖性生长细胞株XG2共同培养,细胞的生长与增殖出现抑制。提示经免疫亲和层析法纯化的可溶性gp130具有良好的生物学活性。     

CD40不同形式的活化对CD40突变的RPMI8226细胞增殖和表型的影响

目的 分析CD40抗体或配体不同形式刺激对RPMI8226细胞增殖及表面共刺激分子和黏附分子表达的影响,探讨RPMI8226细胞CD40基因突变在其生物学行为中的作用.方法 用RT-PCR方法和DNA序列测定检测RPMI8226细胞CD40基因突变体,分析RPMI8226细胞经CD40抗体或配体四种不同方式(CD40单抗、CD40单抗包板、rhsCD40L和CD40L转基因细胞)刺激后,其体外生长曲线、细胞表型及细胞周期的变化,并利用激光共聚焦显微镜对RPMI8226细胞表面CD40信号转导体的形成进行初步分析.结果 RPMI8226细胞表达CD40突变体(TCA→TTA,Ser→Leu),但是该点突变并未影响hmuCD40的抗原表位.三种激发CD40活化的分子(CD40单抗、rhsCD40L和CD40L转基因细胞)并不影响RPMI8226细胞的体外增殖,但是CD40单抗包板能明显抑制RPMI8226细胞的增殖[(2.5±0.6)×105 vs (7.8±1.2)×105,P＜0.05],并产生明显的G1期阻滞[(58.0±3.6)% vs (42.0±2.3)%,P＜0.05].RPMI8226细胞上黏附分子和共刺激分子的表达无明显变化.激光共聚焦显微镜分析结果显示,在CD40被激活后能形成CD40信号传导的复合体.结论 RPMI8226细胞高表达一种CD40基因突变体,该突变体能在被激活后形成相应的信号传导复合体.     

4-1BBL逆向信号促进单核细胞的增殖和分泌细胞因子的作用

采用抗人 4 1BBL单克隆抗体 1F1包被 2 4孔培养板 ,加入经免疫磁珠阴性选择获得的高纯度人外周血单核细胞 ,动态观察细胞的生长状态 ,并用3 H TdR掺入法分析单核细胞增殖 ,应用ELISA动态测定培养上清中IL 6、IL 10、M CSF和FL等细胞因子水平。结果发现 1F1非常有效地促进单核细胞的增殖 ,1F1组单核细胞分泌高水平的M CSF以及IL 6和FL增加 ,但 1F1组单核细胞分泌IL 10水平低于对照组 (P <0 0 5 )。由此表明 ,抗人 4 1BBL单克隆抗体 1F1通过激发单核细胞 4 BBL逆向信号 ,介导单核细胞分泌M CSF、IL 6和FL。上述细胞因子联合作用 ,从而促进了单核细胞的增殖。     

鼠抗人B7-2单克隆抗体的研制及生物学特性研究

以天然高表达膜型B7-2分子的人恶性B淋巴瘤经胞株Daudi和B7-2基因转染细胞株L929-B7-2为免疫原及检测细胞株,采用B细胞杂交瘤技术建立了1株稳定分泌抗人B7-2单抗的杂交瘤,命名为6A5。快速定性试纸法鉴定6A5属小鼠IgG1亚类。经体内诱生腹水法制备单抗,小鼠腹水形成的阳性率为80%,腹水的收获量平均为5.9 ml/只小鼠。经免疫亲和层析法纯化,腹水中抗体蛋白的得率为1.1 mg/ml。采用间接免疫荧光法及流式细胞仪分析,单抗6A5与L929-B7-2、PBTC、Raji和Daudi的阳性结合率分别为99.9%、4.6%、90.6%和99.1%。将6A5(终浓度为5μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,6A5对Daudi细胞的生长在24 h内具有抑制作用(P<0.05)。以丝裂霉素处理的L929-B7-2为刺激细胞,PBTC为反应细胞,加入6A5共同培养。经MTT法分析,6A5能阻断B7-2介导的协同刺激信号,抑制PBTC增殖(P<0.05)。提示6A5是一株功能性抗体,在B7-2分子相关的基础和应用研究中具有重要的价值。     

移植物抗宿主病小鼠肝脏及异体CD8~+T细胞趋化因子和趋化因子受体表达分析

为探讨趋化因子及其受体介导的效应性细胞迁移在移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)发生发展中的重要作用,采用次要组织相容性抗原异配的GVHD小鼠模型,应用流式细胞分选术(FACS)、实时荧光定量聚合酶链反应等方法,分析GVHD靶器官和异体CD8+T细胞趋化因子及受体的表达。肝脏高表达干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、干扰素诱导的T细胞趋化因子(ITAC)、γ干扰素诱生单核因子(MIG)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α/β等趋化因子。异体CD8+T细胞上则高表达CXC趋化因子受体(CXCR)3和CC趋化因子受体(CCR)5。随着肝脏趋化因子的表达增加,异体CD8+T细胞迁移浸润的数量也增高。因而趋化因子及异体CD8+T细胞上趋化因子受体的特异对应关系,促使大量异体CD8+T细胞迁移浸润并造成肝脏损伤。     

人OX40L在BL-21大肠杆菌中的表达和生物学功能研究

目的：克隆和表达人可溶性OX40L重组蛋白(sOXdOL)，探讨OXdOL信号在T细胞对乳腺癌细胞反应中的协同刺激效应。方法：运用基因工程技术在大肠杆菌中表达人重组融合蛋白GST-sOX40L，Western blot分析表达蛋白的特异性；采用体外T细胞和乳腺癌细胞混合培养体系，观察对T细胞生长和增殖的影响。结果：构建了GST-sOX40L原核表达体系，从而进行重组蛋白的有效表达；纯化的重组蛋白通过免疫印迹分析能被特异性单抗识别，并在体外培养体系中显示出协同刺激T细胞对乳腺肿瘤细胞的反应性：促进T细胞生长、增殖以及IL-2的分泌。结论：成功地研制了具有生物学活性的sOX40L，为体外激发肿瘤特异性T细胞提供良好的物质基础。