Bcl-x微基因及其突变微基因的构建与鉴定

背景:Bcl-xL/Bcl-xS比值的增高与肿瘤的发生密切相关,其机制尚未阐明.Bcl-x微基因是研究其选择性剪接机制的重要工具.目的:构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因,为进行Bcl-x基因选择性剪接方面的研究打下基础.方法:首先采用PCR法从人白血病细胞K562基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5'部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3'端及外显子3部分序列,定向插入上一片段下游,构建成pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因,测序鉴定无误后,用pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因瞬时转染HL-60,通过RT-PCR方法对其在细胞内表达作进一步鉴定.另外,以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PCR法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M).结果与结论:以人白血病细胞K562基因组DNA为模板,P1和P2为引物,经PCR扩增得约686 bp的目的片段;以P3和P4为引物扩增出约178 bp的目的片段.微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x分别经Xba Ⅰ和Eco R Ⅰ双切、Xba Ⅰ和Xho Ⅰ双切鉴定均得到预期的片段,突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)经EcoR Ⅰ单酶切后,均得到预期片段,测序结果正确,表明成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因.     

Bcl-x微基因及其突变微基因的构建与鉴定

背景：Bcl-xL/Bcl-xS比值的增高与肿瘤的发生密切相关,其机制尚未阐明。Bcl-x微基因是研究其选择性剪接机制的重要工具。 目的：构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因,为进行Bcl-x基因选择性剪接方面的研究打下基础。 方法：首先采用PCR法从人白血病细胞K562基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5’部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3’端及外显子3部分序列,定向插入上一片段下游,构建成 pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因,测序鉴定无误后,用pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因瞬时转染HL-60,通过RT-PCR方法对其在细胞内表达作进一步鉴定。另外,以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PCR法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)。 结果与结论：以人白血病细胞K562基因组DNA为模板,P1和P2为引物,经PCR扩增得约686 bp的目的片段;以P3和P4为引物扩增出约178 bp的目的片段。微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x 分别经Xba Ⅰ和Eco RⅠ双切、Xba Ⅰ和Xho Ⅰ双切鉴定均得到预期的片段,突变微基因 pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)经EcoR Ⅰ单酶切后,均得到预期片段,测序结果正确,表明成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因。     

sHLA—I对肾移植排斥反应的研究进展

慢性排斥反应是影响移植肾长期存活的主要原因．而急性排斥反应一直是导致慢性排斥反应的重要危险因素，也是器官移植受者最常发生的。在近20多年中，随着免疫抑制剂的广泛应用．急性排斥反应的发生率虽然有所下降．但移植肾的长期存活率并没有显著提高．这在一定程度上是因为我们对一些移植物的轻微病理炎症没能够及时诊断和治疗。排斥反应的最终结果就是移植物的破坏和功能丧失。对急性排斥反应做出早期诊断，随即采取相应的治疗措施，可以挽救移植肾功能。急性排斥反应的及时治疗和逆转．也十分有利于远期移植肾功能的改善。因而，早期诊断急性排斥反应的重要性显而易见。     

肺鳞癌及腺癌中NGAL表达的免疫组化研究

目的：探讨中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）在肺鳞癌及腺癌组织及远癌组织中的表达及与临床病理因素的关系。方法应用免疫组织化学方法检测 NGAL在35例肺鳞癌、30例肺腺癌组织及相应42例癌旁肺组织中的表达,分析其与病变类型的关系及其在癌组织的表达率与临床病理特征的联系。结果 NGAL在肺腺癌组织中的阳性表达率明显高于肺鳞癌组织;而二类癌组织中的阳性表达率又明显高于相应的癌旁组织,淋巴结转移组高于无淋巴结转移组。阳性表达与患者年龄、性别、吸烟情况、病理类型、分化程度无关（P＆gt;0.05）。结论 NGAL在肺鳞癌及腺癌肿瘤组织内的高表达,且与肿瘤类型有关,有可能成为预测肺鳞癌及腺癌发生发展的肿瘤标志物。     

bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立

目的利用bcl-x微基因(minigene)构建重要顺式作用元件B2G、CRCE2的突变微基因,建立bcl-x微基因报告法并应用于bcl-x选择性剪接机制的研究。方法以构建成功的pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PCR的方法,按碱基互补配对原则设计能让顺式元件B2G,CRCE2定点突变的引物,进行PCR反应。PCR反应结束后,用DpnⅠ对模板质粒DNA进行消化,然后使PCR产物发生自身环化反应。将环化产物转化入感受态DH5α,通过筛选并最后利用测序来鉴定所构建突变微基因成功与否。结果测序结果鉴定,所克隆的突变微基因序列碱基无一错误突变。并且在HL-60细胞中,RT-PCR实验表明bcl-x顺式作用元件B2G,CRCE2对bcl-xL/bcl-xS有一定影响,pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G(M)转染后RT-PCR电泳显示bcl-xS几乎消失,pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2(M)转染后RT-PCR电泳显示bcl-xL/bcl-xS为1.6。结论成功构建及应用人类凋亡相关基因bcl-x的突变微基因,顺式作用元件B2G缺失使bcl-xS几乎消失,CRCE2突变使bcl...     

NGAL基因克隆载体的构建与鉴定

目的 构建中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)基因克隆载体.方法 RT-PCR扩增宫颈癌Hela细胞NGAL cDNA片断,将纯化后PCR产物插入pGEM-T载体,构建重组质粒,重组子通过琼脂糖电泳、特异性内切酶切割及测序予以鉴定.结果 成功构建了NGAL基因克隆载体2个.结论 为NGAL基因的定量检测提供了基本实验条件.     

非小细胞肺癌组织中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白表达及其临床意义探讨

目的探讨中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）组织中的表达及其临床意义。方法收集江西省胸科医院2009-03-17-2012-03-23经手术切除的65例NSCLC及癌旁组织,其中鳞癌35例,腺癌30例。实时荧光定量PCR检测NGAL mRNA的表达;免疫组化技术检测NGAL蛋白的表达,并分析其与临床病理特征的相关性。结果鳞癌组织NGAL mRNA检测结果与β-actin的ΔCt之差为-2.3±1.2,腺癌组织为-2.8±1.5,差异无统计学意义,P〉0.05;但两者与癌旁组织的表达水平-1.6±1.3比较,差异均有统计学意义,q值分别为3.568和5.811,P值均〈0.05。腺癌组织NGAL蛋白表达阳性率为80.0%（24/30）,鳞癌组织为57.1%（20/35）,癌旁组织为32.3%（21/65）,3组样本两两比较差异均有统计学意义,P值均〈0.05。但其蛋白表达与患者性别、年龄、吸烟和有无淋巴结转移差异无统计学意义,P值均〉0.05。结论 NGAL在NSCLC组织内高表达,并且与其分型有关,可能成为NSCLC早期诊断的标志。     

sHLA-Ⅰ对肾移植排斥反应的研究进展

慢性排斥反应是影响移植肾长期存活的主要原因,而急性排斥反应一直是导致慢性排斥反应的重要危险因素[1],也是器官移植受者最常发生的.在近20多年中,随着免疫抑制剂的广泛应用,急性排斥反应的发生率虽然有所下降,但移植肾的长期存活率并没有显著提高,这在一定程度上是因为我们对一些移植物的轻微病理炎症没能够及时诊断和治疗.排斥反应的最终结果就是移植物的破坏和功能丧失.对急性排斥反应做出早期诊断,随即采取相应的治疗措施,可以挽救移植肾功能.急性排斥反应的及时治疗和逆转,也十分有利于远期移植肾功能的改善.因而,早期诊断急性排斥反应的重要性显而易见.