湖北地区汉族变应性哮喘患儿Tim-3启动子区基因多态性研究

目的 探讨湖北地区汉族儿童T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白．3（Tim-3）启动子区1541位C〉T和574位G〉T单核苷酸变异及其与变应性哮喘易感性之间的关系。方法 分别采用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和引物特异PCR-核酸序列测定技术检测湖北143例哮喘患儿和72名健康儿童Tim-3启动子区1541位C〉T和574位G〉T单核苷酸变异，讣算基因型和等位基因频率。结果 湖北地区健康儿童Tim-3启动子区1541位C／C、C／T和T／T基因型频率分别是0．961、0．039和0，而哮喘患儿频率分别为0．935、0．065、0，其基因型频率与对照组差异无统计学意义（r=0．3825，P=0．5362）；湖北健康儿童中Tim-3启动子区574位G／G、G／T和T／T基因型频率分别为0．992、0．008和0，而哮喘患儿频率分别为0．941、0．059、0，两组基因型频率差异有统计学意义（χ^2=4．134，P=0．042）。结论 湖北汉族儿童Tim-3启动子区存在多态性变异，其中574位G〉T多态性可能与湖北汉族儿童变应性哮喘易感性有关。     

血清前白蛋白和白蛋白测定在烧伤患者中的临床应用研究

目的探讨烧伤患者血清前白蛋白(PA)和白蛋白(ALB)的变化规律,为临床诊治提供实验依据。方法以2008年6月～2008年12月入住我院的61例烧伤患者作为研究对象,以40例正常健康人为对照,检测烧伤患者和正常健康人血清前白蛋白和白蛋白水平,用统计学方法进行分析。结果烧伤患者血清前白蛋白和白蛋白水平与正常对照有显著性差异,烧伤患者血清前白蛋白比白蛋白下降多而恢复快。结论烧伤患者血清前白蛋白和白蛋白降低程度与烧伤程度呈正相关,血清前白蛋白持续严重下降则预后不良,动态监测烧伤患者血清前白蛋白比白蛋白更有意义。     

mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定

目的构建mTORsiRNA重组表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞mTOR基因的相关研究奠定基础．方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6／GFP／Neo中构建重组表达载体,转化DH5c~菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染人巨噬细胞RAW264．7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Westernblot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTORsiRNA重组表达载体。Westernblot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约4l％。结论mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选,该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。     

前列腺液DD3 mRNA检测在前列腺癌早期诊断中的应用

目的探讨前列腺液DD3 mRNA检测在前列腺癌早期诊断中的应用价值。方法收集前列腺癌患者、良性前列腺疾病患者和非前列腺疾病患者的前列腺液,采用RT-PCR方法对其中的DD3 mRNA表达进行研究,分析三组患者DD3 mRNA表达的差异,探讨DD3 mRNA表达与前列腺癌临床分期和病理分级的关系。同时用ROC曲线对DD3 mRNA诊断前列腺癌的效能进行分析。结果前列腺癌组DD3 mRNA表达量明显高于良性前列腺疾病组和非前列腺疾病组,差异具有显著性(P<0.05),而后两组之间差异无显著性;前列腺癌患者DD3 mRNA表达量与临床分期无关,但不同病理分级之间差异有显著性(P=0.017);DD3 mRNA的ROC曲线线下面积高于tPSA线下面积,当DD3 mRNA相对含量值取0.63时其诊断效能最高。结论前列腺液DD3 mRNA检测对于前列腺癌的诊断具有较高的灵敏度和特异性,作为前列腺癌的诊断指标具有较好的发展前景。     

类风湿关节炎患者血清NO和CRP水平变化及临床意义

目的探讨血清中血清NO和C反应蛋白（CRP）在类风湿性关节炎（RA）发生、发展中的作用。方法选择57例RA患者（活动期36例,非活动期21例）和35例健康体检者（对照组）,采用硝酸还原酶法检测其血清NO水平,用双抗体夹心ELISA方法测CRP水平。结果活动期RA患者血清NO、CRP水平均高于非活动期患者和健康对照者,而非活动期RA患者血清NO、CRP水平亦高于对照组。RA患者血清NO与CRP水平呈正相关。结论RA患者血清NO、CRP水平显著增高可以作为判定RA活动的重要参考指标,检测血清NO、CRP水平有助于RA病情的监测。     

不同生化分析仪检验结查可比性验证

目的对本科室四台生化分析仪进行可比性验证。方法参照WS/T407-2012对我科四台全自动生化分析仪(OLYMPUS AU5421、日立7180、日立7600、Dimension EXL)检测19项急诊常规项目(K~+、Na~+、Cl~-、Ca~(2+)、GLU、UREA、Cr、UA、ALT、AST、CK、ALP、GGT、TP、ALB、TBIL、DBIL、AMY、CK-MB)对三台全自动生化分析仪(OLYMPUS AU5421、日立7180、日立7600)检测另10项常规项目(P~(3-)、TC、TG、HDL、LDL、LDH、apo A1、apo B、LP(a)、Mg)的检测结果进行了比对,并对比对结果进行了分析。结果 1、四台生化分析仪检测高值样本的K+、Na+、Cl-、Ca~(2+)、GLU、UREA、Cr、TBIL、DBIL和CK-MB时其检验结果可比性不达标;四台生化分析仪检测低值样本的K~+、Na~+、Cl~-、Ca~(2+)、UREA、Cr、UA、ALT、TBIL、DBIL时其可比性检验结果不达标;2、三台生化分析仪检测高值的Cl~-、Ca~(2+)、P~(3-)和CK-MB,检测低值的Na~+、Cl~-、Ca~(2+)、P~(3-)、UREA和DBIL的可比性检验结果不达标;3、用高值样本进行可比性验证达标率要高于用低值样本进行可比性验证的达标率,且高低的R值相对偏小。结论从数理角度来分析用高值样本进行可比性验证达标率要高于用低值样本进行可比性验证的达标率是由于数据大时计算出的R就会相对偏小,认为从临床意义的角度考虑选择医学决定水平处的浓度样本进行比对应该是比较合理的;WS/T407-2012由于方法简便实际临床实验室可采用本方法进行比对验证并可增加比对频次。     

回收试验与基质效应评价

目的探讨用回收试验来评估经过物理或化学方法处理过的样本在分析过程中是否存在基质效应。方法分两组,一组为新鲜人血清标本组,另一组为非新鲜血清标本组(包括商品化室内质控品、校准品、卫生部和省临检中心室间质评标本),采用葡萄糖回收试验,观察相同测定条件(相同仪器、相同试剂、同批次测定等)下回收率的差异。结果两组回收率差异有显著性,P<0.05,两组平均回收率及CV值分别为102%,2.5%和136%,12.5%。结论相同测定条件下,两组回收率的差异主要是由于基质效应引起,因此用回收试验来反映处理过的样本基质效应是可行的。     

构建及鉴定TACO特异性10-23DRz表达载体重组耻垢分枝杆菌

目的 构建一种可表达特异性10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DZ)的巨噬细胞靶向性细菌载体疫苗,并鉴定其在巨噬细胞表达10-23DZ的能力以及抑制靶基因表达的效果.方法 采用亚克隆方法将分枝杆菌复制子oriM克隆入10-23DRz真核表达载体pSDE01中,获取可在分枝杆菌和真核细胞中穿梭的重组质粒pSDE02.在前期研究基础上选择一有效的针对巨噬细胞taco基因的10-23DZ--DZ1,根据DZ1序列设计并制备DZ1的双链表达序列,插入pSDE02中获取重组质粒pDZM01.将pDZM01经电穿孔方法转化入耻垢分枝杆菌Ms1-2c株构建重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1.分别采用Ziehl-Heelson染色法和直接荧光观测法鉴定重组耻垢分枝杆菌的巨噬细胞靶向性.用rMS-DZ1感染巨噬细胞株RAW264.7,分别于感染后的24 h和48 h采用斑点杂交方法检测rMS-DZ1在巨噬细胞中表达DZ1的情况,再分别采取RT-PCR和免疫印迹方法检测巨噬细胞TACO表达的差异.结果 限制性内切酶酶切、菌落PCR及测序结果显示pSDE02、pDZM01和rMS-DZ1构建成功.rMS-DZ1感染RAW264.7细胞后24 h和48 h,经点杂交方法均检测到了DZ1的表达.半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果显示,与未感染组比较,rMS-DZ1感染后24 h和48 h时巨噬细胞TACOmRNA分别下降了67.90%和57.14%,TACO蛋白水平分别下降了53.85%和68.92%.同时,表达对照寡脱氧核糖核苷酸DZ1U的重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1U感染RAW264.7细胞后,其TACOmRNA和TACO蛋白水平与未感染组比较均无明显差异.结论 本研究成功构建了一种可表达特异性10-23DZ的巨噬细胞靶向性重组耻垢分枝杆菌的载体,可在巨噬细胞内表达并抑制相应靶基因的表达,可作为研制治疗用疫苗的基础,这也是国内外首次报道可表达10-23DZ的细菌性载体.

Abstract：

Objective To construct a recombinant bacterial vaccine which can express specific 10-23 deoxyribozyme(DZ) in macrophage, identify the intracellular production of specific 10-23DZ and detect the activity of this recombinant bacterial vaccine on inhibiting the expression of TACO gene in macrophage.Methods The pSDE02 was obtained by inserting the replicon of Mycobacterium into pSDE01, a plasmid which can express 10-23DZ in eukaryotic cells. The expression sequence of DZ1, a 10-23DZ targeting the TACO mRNA of macrophage designed in our previous study was synthesized and inserted into pSDE02. The resulted plasmid was named pDZM01. pDZM01 was then transferred into Mycobacterium smegmatis by electroperation. The recombinant M. smegmatis, named rMs-DZ1 was screened on low-salt LB medium containing Zeocin and identified by Colony PCR. The targeted delivery property of recombinant M. smegmatis was observed by Ziehl-Heelson stain and GFP expression observation via fluorescence microscope. rMs-DZ1 was used to infect RAW264.7 cells and the expression of DZ1 in macrophage was identified by dot-blot assay. At 24 h and 48 h after infection, total RNA and proteins were extracted and the TACO mRNA and protein expression level was assayed by RT-PCR and western-blot respectively. Results Restrictive analysis and sequencing data showed that the Mycobacterium-eukaryotic cell shuttle plasmid pSDE02 and pDZM01 was successfully constructed. rMs-DZ1 was confirmed by colony PCR. When engulfed by macrophage, rMs-DZ1 would express DZ1 in RAW264.7 cells and inhibit the expression of taco gene. When compared to uninfected macrophage, rMs-DZ1 significantly reduced the taco mRNA by 67.90% and 57.14% and down-regulated the expression of TACO protein by 53.85% and 68.92% at 24 h and 48 h respectively. Conclusion A recombinant M. smegmatis vaccine was successfully constructed which could generate specific 10-23DZ in macrophage and inhibit the expression of target gene of interest. To our knowledge, this is the first bacterial vector which can express intracellularly 10-23DRz in targeted manner. This study may further prompt the feasibility of using 10-23 DNAzyme to achieve effective and targeted gene silence.