凝血酶原复合物制备过程吸附条件的研究

目的探讨凝血酶原复合物制备过程凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的吸附条件,提高活性收率。方法选择DEAE-SephadexA-50凝胶平衡体系中柠檬酸钠、氯化钠、pH 3种可变因素,每因素取3水平,根据L9(33)正交表设计试验,配制平衡液,分别对DEAE-SephadexA-50凝胶进行平衡处理后,按1.67g/L加入等量健康人混合去冷沉淀血浆,4℃搅拌,吸附凝血因子;吸附后凝胶洗涤、洗脱,检测洗脱液中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性并进行活性回收率正交试验直观分析,获得较优吸附条件并进行验证。此外,分析吸附平衡体系电导率与4种因子活性收率间关系。结果柠檬酸钠、氯化钠、pH对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ吸附影响不同;在所考察范围内,pH对4种凝血因子吸附影响效应趋势一致,pH越低,吸附效果越佳;柠檬酸钠及氯化钠浓度对4种凝血因子吸附影响效应趋势不一致,柠檬酸钠浓度越高,凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ吸附越佳,而凝血因子Ⅸ在(0.012～0.02)mol/L水平较佳;氯化钠浓度越低,凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ吸附越佳,而凝血因子Ⅹ在(0.1～0.14)mol/L水平较佳;平衡体系电导率与4种因子活性收率间不存在线性关系。结论吸附条件中pH及柠檬酸钠浓度对凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ吸附效果影响较大。柠檬酸钠(0.02～0.028)mol/L,氯化钠(0.02～0.06)mol/L,pH6.6～6.9条件,4种凝血因子吸附效果相对较佳。电导率对4种因子吸附效果影响不明显。     

中国市场人凝血因子Ⅷ质量分析

目的考察了5种、11个批次的中国市场人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品,分析相关制品的成份。研究对国内制品的有效性和安全性做出评估,为建立新的制品质量标准提供理论依据。方法选用S公司人FⅧ、CSL Alevi-ate、+公司人FⅧ、L公司人FⅧ和Bayer KogenateFS,通过FⅧ测定进行制品活性评估,通过FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅨ、FⅩ分析杂质蛋白含量,用3种不同蛋白测定方法测定制品总蛋白含量;初步评价von Willebrand Factor(vWF)活性,并用非还原和还原SDS-PAGE电泳分析纯度。结果不同制品在活性检测、蛋白含量测定和电泳纯度评估中均有不同的表现差异。结论不同的工艺制备流程导致不同的制品质量;凝血因子类制品测定不同的方法、设备和检测试剂盒都对数值造成不确定性;甘氨酸影响Bradford法总蛋白含量测定,目前考察的几种FⅧ的关键性质量参数-比活性均大于WHO高纯度(10 IU/mg)和2010版中国药典(1IU/mg)的要求。     

4种静注人免疫球蛋白制品的自身IgG抗体多样性研究

目的 建立静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin, IVIG)制品自身IgG抗体谱展示方法及抗体种类分析方法,考察比较国内不同血液制品企业市售IVIG自身IgG抗体多样性。方法 收集我国4个血液制品企业IVIG为研究对象,以人脐静脉内皮细胞总蛋白为抗原,通过双向电泳结合蛋白印记方法展示不同IVIG的自身抗体谱,通过IVIG与人类蛋白质组芯片杂交,高通量鉴定不同IVIG中自身抗体的种类并进行生物信息学分析。结果 建立了IVIG自身抗体谱展示方法和抗体种类分析方法,获得了较高质量的IVIG自身抗体谱以及其能够识别的人自身蛋白的生物学信息,不同IVIG制品识别自身抗原的数量、种类有明显差异。4个制品针对人脐静脉内皮细胞蛋白抗体数量分别为241～386个;识别人蛋白质芯片上蛋白数量分别为292～435个,有172个人自身蛋白被4个制品均识别。结论 利用抗体谱展示和蛋白质芯片技术能够用于分析IVIG中自身IgG抗体数量及种类多样性,检测的4个厂家IVIG制品中均具有广谱自身抗体,且具有各自的独特性。     

不同吸附体系及因素水平对PCC中4类抗凝蛋白的影响研究

目的 探讨不同吸附体系及其柠檬酸钠、氯化钠、pH、电导4因素对凝血酶原复合物(PCC)中蛋白C、蛋白S、蛋白Z、抗凝血酶收率及比活的影响.方法 选择柠檬酸钠、氯化钠、pH3因素3水平设计正交试验,配制9种PCC平衡吸附体系;凝胶平衡后,吸附血浆,洗涤、洗脱,制备PCC浓缩物;测定浓缩物中蛋白C和S、抗凝血酶活性、蛋白Z含量、总体积及蛋白浓度,获得四类抗凝蛋白收率及比活,比较不同吸附体系收率、比活总趋势;利用正交试验直观分析法分析柠檬酸钠、氯化钠、pH对蛋白C、S和Z收率及比活的影响;测定吸附体系电导率,分析电导率与4类抗凝蛋白收率及比活的关系.结果 不同吸附体系4类抗凝蛋白收率及比活有较大差异,抗凝血酶二者均极低.柠檬酸钠对蛋白C收率及比活、蛋白S收率影响较大;pH对蛋白S比活、蛋白Z收率及比活影响极差分别为:0.120、6.847、0.716,高于其他因素;氯化钠对其影响均最小.柠檬酸钠浓度越低,蛋白C收率及比活越高,蛋白S收率则越低,0.015 mol/L水平蛋白Z收率为49.11％,高于其他水平,而蛋白S和Z比活最低;pH越低,蛋白Z收率则越高,pH7.0水平蛋白C和S收率及比活、蛋白Z比活最高;氯化钠浓度0.075 mol/L水平,蛋白C收率及比活、蛋白S和Z比活分别为:29.37％、0.533 IU/mg、0.401 IU/mg、2.362 μg/mg,均高于其他水平,而蛋白S、Z收率最低.不同电导率条件,蛋白C收率及蛋白Z比活变化较大,其中蛋白Z与S收率、蛋白Z与S比活、蛋白C收率与比活变化趋势基本一致;(10.00±0.20) ms/cm条件,蛋白C、S和Z比活较高.结论 不同吸附体系抗凝血酶收率及比活均极低,蛋白C、S和Z收率及比活间无规律性.氯化钠对蛋白C、S和Z收率及比活影响较小,柠檬酸钠、氯化钠、pH不同水平对蛋白C、S和Z收率影响效应无共性,0.01 mol/L柠檬酸钠,0.075 mol/L氯化钠、pH7.0水平蛋白C、S和Z比活最佳.电导率与四类抗凝蛋白收率及比活间无线性关系.     

亲和凝胶分离纯化人α1-抗胰蛋白酶的研究

目的 探索通过免疫亲和层析从Cohn法组份Ⅳ分离纯化人α1-抗胰蛋白酶浓缩物的方法.方法 24℃下,将Cohn氏法组份Ⅳ用Tris缓冲液抽提0.5h后,离心4 750 g×15 min,上清液加入亲水型气相二氧化硅脱脂后,离心6 000 g×15 min,再用1.2 μm的滤膜过滤;通过GE公司新型的Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和凝胶层析柱,对α1-抗胰蛋白酶进行纯化.用考马斯亮蓝法通过紫外分光光度计测定总蛋白含量;用SDS-PAGE鉴定α1-抗胰蛋白酶的纯度,并用Western Blot和串联质谱分析鉴定纯化的蛋白;通过发色底物法测定α1-抗胰蛋白酶活性.结果 纯化的α1-抗胰蛋白酶在非还原性SDS-PAGE图谱上呈现1条54 kD左右的蛋白带和1条约140 kD的多聚体蛋白带,经过还原性SDS-PAGE多聚体条带解聚,Western Blot也可以反应相关变化;在经过前处理和亲和层析后,α1-抗胰蛋白酶活性回收率为(60.35±1.39)％,α1-抗胰蛋白酶总活性回收率为(41.88±6.98)％,纯化倍数为(71.68±1.32)倍,比活性大约(1.00～1.05)PU/mg.结论 GE公司Alpha-1 Antitrypsin Select免疫亲和层析亲和层析可以从Cohn氏法组份Ⅳ中特异性捕获α1-抗胰蛋白酶浓缩物.     

不同地区人群血浆标本中大肠杆菌O157∶H7的抗体谱差异分析

目的分析来自不同地区、具有不同遗传背景的献血浆者血浆抗体谱差异。方法收集血型、年龄、性别相匹配的来自巴马长寿地区有家族长寿背景和无家族长寿背景的血浆以及某东部地区的血浆各22份、即为3个大组,共66份血浆标本。每大组设置2个生物学重复,共6个小组,每个小组均为11份血浆各50μL等体积混合而成。以肠出血性大肠杆菌O157∶H7蛋白质组作为抗原库,利用蛋白质双向电泳技术和蛋白免疫印迹杂交技术获得不同血浆标本IgG的抗体谱,采用双向电泳图像分析软件进行差异分析。结果通过建立的方法获得了较高质量的血浆标本IgG抗体谱,3组标本中的IgG分别识别198、190和149个大肠杆菌蛋白质点;巴马地区有家族长寿背景和无家族长寿背景的血浆标本IgG抗体谱未见明显差异;但二者与东部地区血浆标本IgG抗体谱相比差异较为明显,如识别抗原数量不同,目标抗原点分布也不同。结论 3组血浆标本均含有针对大肠杆菌O157∶H7的广谱抗体;来自同一地区的血浆标本IgG抗体谱较为一致,来自不同地区人群的血浆标本IgG抗体谱差异明显,提示生活环境及遗传背景可能会影响人血浆中针对外来抗原的抗体的种类与多样性。     

IVIG对PMA诱导的人巨噬细胞吞噬功能的影响

目的研究静脉注射人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)对佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)体外诱导分化成的人巨噬细胞吞噬功能的影响,探讨IVIG对自身免疫性疾病的免疫抑制作用。方法首先利用PMA体外诱导人急性单核白血病细胞THP-1分化形成巨噬细胞;然后利用流式细胞技术比较不同浓度的IVIG对巨噬细胞吞噬致敏红细胞的吞噬功能的影响。结果使用100 ng/m L PMA诱导THP-1细胞24 h,可成功诱导分化形成巨噬细胞。此外,当IVIG浓度为10μg/m L时,可完全抑制巨噬细胞对致敏红细胞的吞噬作用。结论IVIG可以有效地抑制巨噬细胞的吞噬功能,且抑制作用呈剂量依赖性。本研究可为进一步保障IVIG制品的质量奠定方法学基础。     

2007～2011年批签发管理制度下的血液制品供应状况

目的分析2007～2011年国内血液制品供应情况和供应特点,对未来血液制品市场供应做出评估,为建立血液制品供应信息管理化提供理论依据。方法从供应品种、批签发批次、生产数量、实际供应数量等多个角度考察2007～2011年我国人血白蛋白,人免疫球蛋白,静注人免疫球蛋白(pH4),人凝血因子Ⅷ等血液制品的批签发信息;分析中国血液制品市场供应情况。结果生物批签发批次从2007年不完全统计的800批次增长到2011年2 353批次,其中人血白蛋白供应量从2007年59.52吨增长到2011年182.93吨,2011年进口人血白蛋白达到78.22吨,占42.76%,国产达到104.71吨,占57.24%;人免疫球蛋白(肌注)2011年减少至183.6 Kg,约合61.2万瓶;静注人免疫球蛋白(pH4)(含冻干剂型)从2007年5.30吨增长到2011年14.15吨;破伤风人免疫球蛋白2011年供应为41 662万IU;狂犬病人免疫球蛋白2011年供应为49 432.3万IU;乙型肝炎人免疫球蛋白2011年供应为65 390.9万IU;其他血液小制品,2011年人纤维蛋白原供应69 901.5 g;2011人凝血酶原复合物供应为4 400.1万IU;2011年人凝血因子Ⅷ供应增长7 159.4万IU。结论施行生物制品批签发管理制度能使国家监管部门更准确地掌握生物制品的生产及质量情况,进一步保证血液制品的临床有效性,提高了血液制品的使用安全性。     

洗脱条件及其因素对凝血酶原复合物有效成分的影响

目的探讨洗脱条件及其因素对凝血酶原复合物(PCC)中凝血因子(F)Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ及蛋白(P)C、S、Z、抗凝血酶(AT)8种有效成分收率及比活的影响。方法选择洗脱条件中柠檬酸钠、NaCl、pH 3种可变因素,每因素取3水平,根据正交表配制不同洗脱体系;采用DEAE-Sephadex A-50凝胶,相同平衡、洗涤条件及上述不同洗脱体系,批式吸附法制备PCC浓缩物;检测浓缩物中8种成分的活性或含量,获得各成分的收率及比活;正交试验分析不同洗脱条件及其因素对8种成分收率及比活的影响。结果不同洗脱条件8种成分收率及比活有一定差异,2.4 mol/L NaCl条件比活总体较高。在所考察范围内,柠檬酸钠对FⅡ、FⅨ、FⅩ、PC、AT收率和PC、PS、AT比活有较大影响;NaCl对FⅦ、FⅩ、PS、PZ收率和FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、PZ比活有较大影响。不同水平条件,柠檬酸钠及NaCl含量越高,4种凝血因子收率与比活越高,但对4种抗凝蛋白收率及比活影响无规律;pH6.6水平,4种凝血因子收率较高,pH6.9,其比活较高,pH对4种抗凝蛋白收率与比活的影响无规律。结论洗脱条件中高浓度的NaCl可提高PCC的整体比活;低浓度的柠檬酸钠对PCC有效成分收率及比活也有较大影响;pH对PCC中凝血因子(FⅡ,Ⅶ,Ⅸ,Ⅹ)收率及比活的影响分别有共性,对抗凝蛋白(PC,PS,PZ,AT)的影响则无规律。     

基于APP/PS1双转基因小鼠初探输血传播阿尔茨海默症的风险

目的 初探输血传播阿尔茨海默病(alzheimer disease, AD)的风险。方法 3、6、9月龄APP/PS1小鼠各10只，雌雄各半，认知行为学能力测定，同龄C57小鼠作对照；采集上述尚未出现行为学改变的最大月龄APP/PS1小鼠血液，检测Aβ₄₀、Aβ₄₂含量后备用。制备Aβ₄₀、Aβ₄₂聚合物，免疫印迹分析后备用。6～7月龄昆明小鼠随机分为6组(10只/组，雌雄各半),实验组1～2尾静脉注射APP/PS1小鼠血液(100μL/只),1组为高频次注射(3次/周),2组为低频次注射(1次/周);实验组3～4注射Aβ₄₀、Aβ₄₂聚合后混合物(100μL/只),分别为高、低频次注射，具体同上；对照组1～2注射等量生理盐水，分别为高、低频次注射。上述组别注射均持续4周，注射完毕1周后进行认知行为学能力检测及分析，最后检测昆明小鼠血液Aβ₄₀、Aβ₄₂含量。结果 3、6月龄APP/PS1小鼠未出现认知行为能力改...