大田软海绵酸液相色谱串联质谱检测方法的研究

目的:利用高效液相色谱-串联质谱法建立海产品中大田软海绵酸(Okadaic acid,OA)的检测方法。方法:贝样品提取液经AccuBondⅡSPE silica固相萃取小柱预分离和富集,用三级四极杆串联质谱(MS/MS)作为HPLC的检测器,使用正离子电喷雾(ESI)电离方式,多反应监测(MRM)扫描模式,选择母→子离子对m/z827→m/z723,m/z827→m/z809作为定量检测的离子对,HPLC的流动相为乙腈:1%甲酸-水(体积比70:30),色谱柱为Agilent Extend-C18(2.1×150 mm,Φ5.0μm),对OA标准品及加标样品和实际样品进行HPLC-MS/MS检测。结果:方法线性回归方程为Y=193.07X-780.6(Q1/Q3:m/z827.4→723.5);Y=83.021X-335.6(Q1/Q3:m/z827.4→809.5),相关系数r2均为0.9991;线性范围为10~800μg/L。样品平均回收率为83.99%,平均RSD为4.34%。结论:建立的HPLC-MS/MS方法灵敏、快速、准确,可用于海产品中贝类样品OA限量标准检测。     

大腹园蛛Avg 1的原核表达及生物学活性

[目的]研究大腹园蛛组织蛋白酶B相关基因Avg 1(基因登录号:AY302573)编码蛋白的生物学特性.[方法]设计合成引物(AvgS,AvgX),扩增Avg 1,去除信号肽部分基因Avg,将其与原核表达载体pET-28a(+),pET-20b连接,转化到E.coliBL21(DE3)中.[结果]鉴定为阳性克隆后,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示Avg-28a-DE3在近35.7ku处出现明显的表达带,其大小与预计分子质量(35.2ku)相当;经薄层扫描分析显示,表达蛋白量占菌体蛋白总量的39.6%,且表达形式主要为包涵体,而Avg-20b-DE3表达产物未见表达带,但RT-PCR方法检测到了Avg mRNA的转录;将表达的包涵体蛋白进行变性及复性处理,与诱导的Avg-20b-DE3表达菌经超声波碎菌处理上清液一同进行蛋白酶活性测定,呈复性的包涵体蛋白不具有酶活性,而Avg-20b-DE3的碎菌上清液显示明显的蛋白酶活性.表达的包涵体蛋白经电洗脱纯化后,常规方法免疫吉绒獭兔,抗血清经ELISA法检测,呈明显阳性反应,经Western blot检测在35.7ku处出现特异结合带.[结论]Avg 1原核表达蛋白具有良好的免疫原性.     

食源性致病菌六联融合毒素的构建及免疫学特性研究

[目的]构建4种食源性致病菌融合毒素基因及重组表达载体,制备六联融合毒素的血清抗体. [方法]采用柔性Linker序列(G-G-G-G-S)对目的基因进行串联(HblA-VT1B-SEA-VT2B-BoNTaHc-SEB),构建重组表达质粒pET-22b(+)-F6并在E.coli BL21中进行表达,将表达蛋白纯化后免疫豚鼠制备血清抗体,利用ELISA和琼脂扩散试验验证抗体的特异性与敏感性. [结果]成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-F6并在E.coli BL21中成功表达,37℃表达蛋白主要以包涵体形式存在(表达量10.2%),基因序列全长3 384bp,编码1 127个氨基酸,蛋白分子量为127 205,测序结果与设计序列一致性为100%.ELISA和琼脂扩散试验表明,融合毒素F6与4种食源性致病菌有良好的反应原性,与多种非目标菌不反应. [结论]成功构建了多联融合毒素基因的表达质粒及制备了抗血清,为利用融合毒素的方法检测食源性致病菌,进而建立食源性致病菌广谱、快速的检测方法奠定基础.     

重金属镉单克隆抗体的制备

重金属对环境及人类存在潜在的持续的毒害作用,建立一种规范的程序,对重金属实施有效的监测。传统的重金属检测方法多采用化学方法检测,如原子吸收光谱分析（atomic abs orption spectroscopy, AAS）、电感耦合等离子发射光谱（inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy, ICP-AES）等,这些方法需要大量的样品预处理,     

邻苯二甲酸单苄酯单克隆抗体的制备

目的制备抗邻苯二甲酸单苄酯(mono-benzyl phthalate,MBzP)的单克隆抗体。方法本实验利用活泼酯法,将邻苯二甲酸单苄酯分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,获得完全抗原MBzP-BSA和MBzP-OVA,用MBzP-BSA免疫Balb/c小鼠,制备杂交瘤细胞,利用ELISA方法检测阳性杂交瘤细胞株分泌抗体的效价。结果获得了稳定分泌抗MBzP的细胞株1B9,以该细胞株体内诱生腹水制备腹水型单克隆抗体,纯化后效价为1∶128 000。结论成功制备了抗邻苯二甲酸单苄酯的单克隆抗体。     

食物中毒菌多联融合毒素Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB的表达及免疫学特性研究

目的构建食物中毒菌多联融合毒素基因及重组表达载体,制备抗5种毒素的血清抗体。方法采用一定的linker序列(G-P-G-P-G)将克隆的3种食物中毒菌的5个毒素基因片段进行串联,并定向克隆到表达载体pET-22b(+)的NcoI和XhoI位点之间,构建五联融合毒素基因及重组表达载体,表达产物经切胶回收初步纯化后免疫獭兔,制备抗血清,利用ELISA和琼脂扩散试验检测抗体和5种毒素反应的特异性和敏感性。结果构建了重组融合毒素(命名为F5)Hc-VT1B-SEA-VT2B-SEB基因和重组表达载体F5-22b,且在表达宿主菌E.coliBL21中得到有效表达(9.90%),基因序列全长2937bp,编码成熟蛋白979个氨基酸,融合蛋白分子量112.369ku,测序结果与设计序列(GenBank)100%同源。表达产物经初步纯化后免疫獭兔获得抗五种毒素的血清抗体,且具有较高的特异性和敏感性。结论成功构建了融合毒素基因,获得了抗五种毒素的血清抗体,本实验结果为下一步建立食品广谱、快速免疫学检测新方法奠定了基础。     

β-酪蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

牛奶具有丰富的营养价值,牛奶中含有多种人类赖以生存的营养素,包括水、蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素等,是人类最理想的天然食品。然而近些年来,随着乳制品产量的逐渐上升,乳品掺假现象也时有发生,严重危害消费者健康。     

我国牛羊主产区小肠结肠炎耶尔森菌的病原特征研究

目的 对2018-2020年我国牛羊主产区牛羊源小肠结肠炎耶尔森菌进行病原特征研究,为该菌的防控提供科学依据。方法 对来自于6个地区的2 291份样本进行分离培养、PCR鉴定、玻片凝集以及药敏试验,以掌握其感染情况、毒力基因型和血清型的分布以及耐药情况。结果 在2 291份样本中,共分离出该菌109株,总检出率为4.76%,其中辽宁地区检出率最高(20.42%),并且各地区检出率差异有统计学意义(χ²=288.153,P<0.01),而各种类样本检出率差异无统计学意义(χ²=1.734,P>0.05)。在本次分离菌株中,ystB基因为优势毒力基因,O∶5,27为优势血清型,菌株对氨苄西林、红霉素、磺胺异恶唑和头孢噻吩耐药率为100%,对多粘菌素B和氟苯尼考敏感率为100%。结论 牛、羊源小肠结肠炎耶尔森菌在全国牛、羊主产区分布不广泛,但其多重耐药率较高,建议加强对该菌耐药性的监测与管理。     

指压法幽门成形术预防食管贲门癌术后返流性食管炎的临床观察

１９９３年７月～１９９５年１０月，我们对３７例食管贲门癌手术患者采用指压法幽门成形术，经与同期４６例未做幽门成形术患者相比，发现行指压法幽门成形术的患者，术后出现返流性食管炎的情况明显减少，现报告如下。１临床资料幽门成形组（指压法）：３７例，年龄４１...     

食管胃拉套法吻合术(附38例临床观察报告)

本文报道了食管胃拉套法吻合术38例。文中对所采用的两种吻合方法进行了详细的描述,该方法具有术野暴露充分等特点,并能减少术后吻合口瘘、狭窄、返流等并发症的发生。