小鼠牙髓干细胞培养及诱导分化

目的 :分离、培养小鼠牙髓干细胞并诱导分化 .方法 :采用酶消化培养法获得小鼠的单个牙髓细胞悬液 ,细胞密度调整为 1× 10 4/孔细胞 ,用 2 0 0mL·L -1胎牛血清的α MEM培养液培养 14d ,挑出细胞克隆消化传代 ,TGF β、BMP2 、bFGF细胞因子诱导 ,PCR检测DSPP的mRNA的表达 .结果 :小鼠牙髓细胞呈集落状生长 ,克隆形成率为 1.6 -2 .5个 / 10 4细胞 ,所形成的集落细胞结合紧密 ,细胞体积小、胞核大 ,经细胞因子刺激后的细胞表达DSPP的mRNA .结论 :培养的小鼠牙髓集落状生长的细胞具有干细胞增殖快等特性 ,细胞因子可诱导小鼠牙髓干细胞定向分化     

MINT蛋白(1-365氨基酸)相互作用分子的筛选

目的 :用酵母双杂交技术筛选与MINT(Msx2 in teractingnucleartargetprotein) F1片段相互作用的分子 ,对MINT转录抑制的机制进行探讨 .方法 :以Mint F1片段 (1～ 36 5氨基酸残基 )连入载体pGBKT7构建的质粒为诱饵 ,利用酵母双杂交技术对人淋巴结cDNA文库进行筛选 ,并分析所获得的阳性克隆 .结果 :从 6× 1 0 7个克隆中共获得 1 2个不重复的阳性克隆 .经序列分析 ,得到 3个有意义的基因 ,分别为人小核RNA 蛋白复合体多肽G(SNRPG)、癌基因Vav和人微球蛋白 1 (MCRS1 ) .结论 :从筛选到的这 3个分子的定位与功能来看 ,MINT分子的N端片段可以与小核RNA 蛋白复合体 (snRNPs) ,Vav,MCRS1和RBP Jκ等相互作用 ,参与细胞内的信号传递 ,调控细胞周期 ,并可能影响RNA的加工与处理     

肿瘤干细胞的研究现状

干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞, 目前已分离培养出多种组织来源的干细胞。同时, 人们亦发现恶性肿瘤进行性生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似, 继而推测肿瘤是干细胞分化增殖失调而产生的异常组织, 并提出了肿瘤发生的干细胞学说 [1]。近期的研究已从血液系统肿瘤、乳腺癌及脑部肿瘤中初步分离出肿瘤干细胞 [2-5], 为这一理论提供了有力的证据。1　肿瘤干细胞肿瘤干细胞的观念并非新生事物。早在四十多年前, 研究者就发现了它们可能存在的迹象。当时观察到只有 1%的白血病细胞可以在培养皿中生…     

RAM7,一种新的核蛋白分子在小鼠中枢神经系统的表达

Notch信号途径参与动物多种组织和器官尤其是神经系统的发育调节。 RBP-Jκ是 Notch信号途径中的关键分子 ,RAM7是近年通过酵母双杂交技术发现的与 RBP-Jκ相互作用的蛋白。本实验表达 RAM7C-末端 60 k D的多肽片段 ,并制备特异性的多克隆抗体 ,检测 RAM7在小鼠中枢神经系统的分布。结果显示 :RAM7主要呈细胞核染色 ,在中枢神经系统中广泛分布 ;尾壳核、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、室周核等核团内没有 RAM7阳性神经元 ,但存在着一定数量的 RAM7阳性神经纤维 ;另有相当多 RAM7胞浆染色的细胞和神经元以及一些胶质细胞 ,局限在脑室和脑室周围的神经组织中。RAM7分子的分布对其可能的生理功能有一定的提示作用     

天然角蛋白自身反应性B细胞亚群及功能的分析

目的:明确天然角蛋白反应性B细胞的亚群及解剖定位,初步分析其分泌天然抗角蛋白自身抗体(anti-keratinautoantibody,AKautoAb)的能力。方法:取SPF级C57BL/6小鼠的脾细胞和腹腔细胞,荧光抗体染色后用流式细胞仪分析角蛋白反应性B细胞亚群。将脾脏和腹腔淋巴细胞体外培养后,用ELISA分析AKautoAb的滴度,用ELISPOT法分析分泌AKautoAb的B细胞数。结果:腹腔中几乎所有结合角蛋白的B细胞均为B-1a细胞,脾脏中结合角蛋白的B细胞以边缘带B细胞为主。腹腔细胞中分泌AKautoAb的细胞数显著多于脾细胞,其培养上清中AKautoAb的滴度显著高于脾细胞。结论:角蛋白反应性B细胞存在于3个成熟B细胞亚群:B-1细胞、滤泡B细胞和边缘带B细胞,其中CD5 的B-1a细胞具有活跃的分泌AKautoAb的能力。     

大鼠β细胞素蛋白的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性。方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )中。以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测。采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白。目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%。表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性。结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖。     

兔BK通道β亚基多克隆抗血清的制备

目的:用小鼠制备抗兔BK通道β亚基的抗血清。方法:采用RT-PCR扩增编码兔BK通道β亚基胞内段的基因。在大肠杆菌中表达GST-β亚基融合蛋白。以从PAGE凝胶上切下的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗血清。用ELISA和Westernblot鉴定抗血清的特异性。结果:用RT-PCR扩增出约300bp的兔BK通道基因。序列分析显示,扩增的序列与已发布的新西兰大白兔骨骼肌BK通道的序列完全一致。在E.coliDH5α成功地表达Mr约为37000GST-β亚基融合蛋白。ELISA和Westernblot检测证明,针对GST-β亚基融合蛋白的抗血清,不仅可特异性地识别GST-β,也可识别源于兔组织的β蛋白。抗血清的最高滴度达1∶128000。结论:克隆了编码兔BK通道β亚基胞内段的基因,并成功地获得可特异性识别新西兰大白兔BK通道β亚基的高滴度抗血清,为BK通道的进一步研究提供了物质基础。     

KyoT2 结合蛋白KBP1对RBP-J介导的转录活性的影响

目的 :研究KyoT2与KyoT2结合蛋白 1(KyoT2 bindingprotein1,KBP1)之间的物理相互作用 ,以及这种相互作用对重组信号结合蛋白J (recombinationsignalbindingprotein Jκ ,RBP J)介导的转录活性的影响。方法 :体外GST pulldown、体内免疫共沉淀、哺乳动物细胞双杂交实验和报告基因实验证实 ,KBP1与KyoT2之间存在物理和功能上的相互作用。结果 :体内和体外证实 ,KBP1与KyoT2之间均存在相互作用。转录活性分析实验显示 ,过表达KBP1可拮抗RING1对RBP J介导的转录的抑制效应。结论 :KBP1可通过与RING1竞争结合KyoT2而间接参与对Notch信号途径的调控     

成人隔疝修补术麻醉体会

近来 ,我们成功地完成了多例成人膈疝修补术的麻醉。现将我们记录完整的 1例报告如下。1　临床资料男 ,36岁 ,体重 76ｋｇ。ＡＳＡⅡ级。病人主诉 1年前因活动后心悸 ,呼吸急促。Ｘ线报告 :膈疝 ,近几个月来症状加重 ,进食后返酸 ,消化不良。ＣＴ报告 :左胸腔内有胃、脾、小肠、结肠等腹腔器官 ,纵隔右移 ,气管右移 ,左肺下叶不张。心电报告 ,窦性心律 ,电轴正常 ,低电压 ,Ｔ波变化不正常心电图。实验室检查均正常。麻醉前检查 :病人精神状态佳 ,营养状态良好 ,屏气试验<30ｓ ,气管明显右移 ,心脏听诊心律齐 ,各瓣口未闻及杂音 ,心率 96次 /…     

人肿瘤坏死因子α单链抗体的原核表达和活性分析

目的　在大肠杆菌中表达抗人 TNF-α单链抗体 (Sc Fv) ,并分析它的结合活性和中和活性 .方法　在获得抗人 TNF-αE6 Sc Fv的基础上 ,用热诱导载体 p BV2 2 0在大肠杆菌中表达 E6 Sc Fv蛋白 .EL ISA测定抗体的结合活性 ,实时 BIA技术确定亲和常数 ,L 92 9细胞毒试验分析其中和活性 .结果　克隆了抗人 TNF-α E6 Sc Fv基因的热诱导载体 p BV2 2 0在大肠杆菌中 ,经42℃热诱导 ,得到了相对分子质量 (Mr)约为 2 70 0 0的重组蛋白质 ,表达量占菌体总蛋白的 18% .对在大肠杆菌中表达的E6 Sc Fv进行了复性和亲和层析纯化 ,并进一步证…