含有纯化标签的重组人表皮生长因子的构建及表达

目的:高效表达和制备有活性的人表皮生长因子(hum an ep iderm al growth factor,hEGF)。方法:用DNA重组技术构建EGF基因并插入表达载体pQE-40,与载体上的6×H is标签融合,获得的表达质粒pQE-EGF转化E.coliM15[pREP4],得工程菌M15[pQE-EGF]。MTT法测定活性,培养工程菌M15[pQE-EGF]并诱导目的蛋白表达,镍离子螯合亲和层析纯化重组EGF。结果:所构建的EGF序列正确,重组EGF在大肠杆菌中以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的21.2%,经镍离子亲和层析一步纯化后的重组EGF纯度达90%,得率为94%。复性后的重组EGF具有促Hela细胞生长活性。结论:以E.coliM15[pREP4]/pQE-40系统表达EGF具有技术路线简单、目的蛋白得率高、成本低等优点,是一种制备活性hEGF的有效手段。     

钴60γ射线灭活人工骨钉PRV病毒效果验证

目的:验证钴60辐照灭活猪源性人工骨钉中指示病毒PRV活性的有效性。方法:首先利用CPE法测定不同辐照剂量γ射线灭活样品后指示病毒的感染活性,初步确定有效辐照剂量;然后利用三批样品对该辐照剂量灭活效果进行验证,辐照前后人工骨钉中指示病毒的滴度采用96孔板CPE法滴定。结果:CPE法测定结果显示,经20kGy及以上辐照剂量处理的样品中指示病毒PRV不能使宿主细胞PK-15出现细胞病变;三批样品经20kGy辐照剂量处理后,指示病毒PRV滴度下降值⊿lgTCID50分别>4.06,>4.75,>4.28,⊿lgTCID50值均大于4。结论:辐照剂量为20kGy的钴60γ射线辐照猪源性人工骨钉可以作为灭活PRV的有效手段。     

重组人Nm23-H1/NDPK-A蛋白抗血清的制备与鉴定

目的：通过实验，制备出NDPK－A蛋白的抗血清，为国内NDPK－A的诊断试剂盒的研究开发提供基础条件。方法：重组人肿瘤转移相关蛋白Nm23-H1/NDPK-A蛋白经Macro-prepDEAE阴离子交换柱层析和CibacronBlue亲和层析，得到了电泳纯的NDPK－A蛋白，以此制备抗原，免疫新西兰纯种兔，进而得到NDPK－A蛋白的抗血清。结果：ELISA法检测所制备的抗体的反应效价为：1：400－800。结论：westernblot试验结果证实。该抗血清具备较好的特异性。能与NDPK－A蛋白发生反应，可应用于NDPK－A蛋白的实验检测利临床检测。     

多角度激光散射测定重组人核苷二磷酸激酶A在溶液中的聚集状态

目的和方法 :对重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPK -A)进行纯化 ,并对重组产物的理化性质及在溶液中的聚集状态进行测定。NDPK -A工程菌发酵后的菌体高压匀浆 ,然后微滤、超滤处理 ,所得样品经DEAE阴离子交换、Cibacronblue亲和层析、分子筛层析 3步纯化后 ,以SDS -PAGE和RP -HPLC分析纯化产物的纯度 ,RP -HPLC测定酶活性。合格制品以基质辅助激光解析飞行时间质谱测定分子量 ;Edman降解法测定N末端序列 ;多角度激光散射法测定重组产物在溶液中的表观分子量。结果 :rhNDPK -A纯化产物的SDS -PAGE纯度为 97 3% ,RP -HPLC纯…     

灭活SARS病毒的纯化鉴定及初步应用

为制备纯化的灭活SARS病毒,取广东省CDC提供的灭活SARS-CoV病毒培养液进行超滤,收集相对分子质量介于100000至500000之间的组分,并浓缩。对纯化过程中各组分进行抗原活性鉴定和蛋白质含量测定,并加佐剂后免疫动物,测定抗体免疫应答。结果表明,超滤后活性抗原蛋白质回收率7.6%,纯化倍数为9,抗原活性达到1:480。免疫家兔获得的血清ELISA效价达到1:10000以上,中和抗体效价达到1:2000以上。表明该纯化工艺能获得较高纯度的灭活SARS-CoV病毒颗粒。     

蓝藻抗病毒蛋白-N的制备、生物活性鉴定及其多克隆抗体的制备和修饰

目的:纯化CVN重组蛋白,检测其抗病毒活性,制备CVN多克隆抗体,并对其进行纯化和修饰。方法:利用两步Ni-NTA亲和层析和一步SUMO酶切制备CVN抗原,CPE法观察其抗病毒活性,活性抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,ELISA及Western blot鉴定其效价和特异性,抗血清经硫酸铵初步沉淀和DEAE离子交换层析获得纯化抗体,纯化抗体通过辣根过氧化物酶(HRP)标记获得修饰抗体。结果:纯化获得纯度达95%以上且具有明显抗流感病毒作用的非融合CVN,利用所得CVN抗原成功制备CVN多克隆抗体,酶联免疫分析显示其效价达到1∶16 000以上,Western blot分析表明其具明显特异性。抗血清经盐析和DEAE离子柱层析后获得效价为1∶6 400高纯度纯化抗体,经HRP修饰后获得具有较高生物活性的标记抗体。结论:获得高纯度,高效价兔抗CVN多克隆抗体,以及HRP标记的兔抗CVN多克隆抗体,为后续研究奠定了基础。     

正常细胞如何人工诱变成癌细胞

正常细胞转化成癌细胞的分子机制一直是肿瘤学研究的热点。但通过特定条件在体外培养基中转化正常人类细胞极难成功。最近在这方面的研究取得了突破性进展，成功地实现了特定条件下（即利用特定基因或其产物）将人工培养的人类正常细胞转化成癌细胞，本文将简要介绍这种转化过程及其分子肿瘤学基础。     

桉叶水提物体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型活性的实验研究

目的：研究直干桉叶水提物体外抗单纯疱疹病毒1型（HSV-1）活性。方法：采用CPE观察实验与空斑减数实验测定直干桉叶水提物抗HSV-1活性，计算其空斑抑制率和IC50，并从药物对病毒的直接灭活作用、对病毒吸附的影响及对病毒穿膜的影响3个方面初探直干桉叶水提物抗HSV-1活性机理。结果：直干桉叶水提物能明显抑制HSV-1的致病变作用，其IC50为84．28μg／ml。药物主要是对病毒有直接灭活作用，也能影响对病毒对细胞的吸附。结论：直干桉叶水提物有显著的抗HSV-1活性，初步推测直干桉叶水提物抗HSV-1活性的机理是影响病毒的囊膜结构从而使之失活。     

HPLC法测定rhNDPK-a酶活性

目的：研究不同反应体系对NDPK酶活性测定结果的影响。方法：分别以(UTP ADP)和(ATP UDP)作为反应底物，加入自制的rhNDPK-A蛋白，以100mmol／L磷酸二氢钾、20mmol／L乙酸、5mmol／L四丁基溴化铵，pH5．0作为流动相A液，A液 25％乙腈作为B液，等梯度混合，C18柱，柱温25％，流速1．0ml／min，检测波长254nm。结果：以(UTP ADP)和(ATP UDP)作为反应底物测定的酶比活分别为210U／mg、860U／mg。结论：不同反应体系对HPLC法测定NDPK酶活性有显著差异。     

Nm23/NDPK的多种生物活性及其机制研究进展

Nm23家族共有8个成员，其蛋白产物为核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDPK）。NDPK的研究历史可以追溯到50年前，作为一种管家酶，NDPK的首要功能是通过催化二磷酸核苷（nucleoside diphosphate，NDP）和三磷酸核苷（nucleoside triphosphate，NTP）之间的磷酸基转移反应来维持细胞内的NTP浓度。近年来的研究发现，NDPK可以调节细胞增殖、分化、发育和凋亡。研究NDPK的多能性及其调控机制对于阐明细胞增殖和分化、肿瘤发生、发展和转移，甚至个体发育，都有重要意义。