日本血吸虫酚氧化酶的组化定位研究

目的观察酚氧化酶(phenol oxidase,PO)在日本血吸虫成虫的组织学分布.方法酚氧化酶组化方法:将42 d虫龄的日本血吸虫活成虫置含25 mmol/L邻苯二酚的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中,37℃孵育30 min后,转移虫体至载玻片上,吸去虫体表面液体,将其中一部分虫体置Olym-pus显微镜下观察酚氧化酶在虫体的组织学分布.荧光组织化学方法:经上述过程处理后,在另一部分虫体上滴加2滴含0.05%戊巴比妥钠的PBS溶液,然后置Leica荧光显微镜下观察酚氧化酶在虫体的组织学分布.结果酶组织化学方法显示,日本血吸虫酚氧化酶仅分布于雌虫卵黄腺及子宫内虫卵卵壳表面,呈现棕褐色显色反应;雌虫卵巢和雄虫均未发现酚氧化酶活性.然而,荧光组织化学方法显示,酚氧化酶除主要分布于雌虫卵黄腺及子宫内虫卵卵壳表面,呈现强荧光外,还少量分布于雄虫体壁表层,呈现弱荧光反应.结论不仅日本血吸虫雌虫含有酚氧化酶活性,而且雄虫也含酚氧化酶活性,只不过其含量少、活性低.荧光组织化学方法能更灵敏地显示日本血吸虫酚氧化酶活性,更适用于日本血吸虫酚氧化酶的组织学定位.     

氯代水杨胺对湖北钉螺组织中酶活性的影响

目的:研究新型灭螺药物氯代水杨胺(LDS)对湖北钉螺组织中相关酶活性的影响,以了解其灭螺机理。方法:实验组用浓度为0.1g/L的LDS浸杀法处理湖北钉螺3h、6h、12h、24h后,解剖钉螺获取软体;阴性对照组与阳性对照组分别用曝气水和浓度为0.1g/L的氯硝柳胺(WPN)对湖北钉螺进行相同处理后,检测各组钉螺软件组织匀浆的谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)与延胡索酸酶活性;乳酸脱氢酶(LDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、细胞色素C氧化酶(CCo)、一氧化氮合酶(NOS)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-PD)、酚氧化酶(PO)活性。结果:LDS处理24h后,与阴性和阳性对照组比较无显著性变化的酶是延胡索酸酶、SDH、ATPase、AchE、AKP和PO;活性减弱的酶是CCo、G-6-PD、NOS;活性增强的酶为LDH、ACP。LDS作用3h、6h、12h、24h过程中,先上升后下降的酶为GPT、GOT、SOD。结论:LDS对湖北钉螺大部分酶活性的影响与WPN基本一致,但对部分酶活性的影响程度与WPN有所差别,如CCo、G-6-PD、NOS、LDH、ACP、SOD。     

日本血吸虫酚氧化酶同工酶分析

目的：观察日本血吸虫成虫单酚氧化酶(monophenol oxidase，MPO)和二酚氧化酶(diphenol oxidase，DPO)的同工酶酶谱形式。方法：将收集到的42d活成虫置含0．05％戊巴比妥钠的RPMIl640培养基中，23℃孵育8h，分别研磨雌、雄成虫呈匀浆，显色单酚氧化酶的样品匀浆时另加5％的TX-100。超声粉碎、低温高速离心取上清(含PO)．进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及酶染色后分析两种酚氧化酶同工酶酶谱形式。结果：单酚氧化酶的同工酶酶谱与二酚氧化酶的同工酶酶谱基本一致，电泳位置相同，表现为迁移率相同的一条带，但是单酚氧化酶的酶谱谱带较二酚氧化酶的酶谱显色弱。同时，雌虫及雄虫的单酚氧化酶和二酚氧化酶亦表现为迁移率相同的一条主带；但雄虫的酶带显色反应较雌虫弱。结论：日本血吸虫成虫体内酚氧化酶存在两种形式：单酚氧化酶和二酚氧化酶。而且不仅雌性虫含有酚氧化酶，雄性成虫也含有少量的酚氧化酶且两者酶分子相同。雄性成虫含有少量酚氧化酶的生理意义有待进一步研究。     

日本血吸虫角化不良蛋白(DKC1)基因克隆与表达

<正>目的:本课题组前期的研究结果显示,在宿主因子作用下,日本血吸虫母胞蚴角化不良蛋白(DKC1)基因呈现差异表达。本研究克隆、表达DKC1基因,为后期研究日本血吸虫DKC1基因的功能奠定基础。方法:通过搜寻DKC1基因的完整开放阅读框(ORF),设计并合成引物,利用PCR技术扩增目的基因片段,双酶切,并将其与PET-28a(+)载体连接,转化入DH5a大肠杆菌,经PCR扩增并测序鉴定后,抽提重组质粒,再将其转化入表达菌BL21大肠杆菌中。PCR鉴定阳性重组克隆后,IPTG诱导表达,SDS-PAGE方法检测表达结果,收集、纯化重组蛋白。     

湖北省引江济汉工程区移民血吸虫病认知情况及其相关行为调查

目的了解湖北省引江济汉工程区移民对血吸虫病的认知情况,并调查其相关行为。方法采用按比例分层随机抽样的方法对工程区移民进行抽样,应用问卷调查和口头访问结合的形式,开展关于血吸虫病认知情况及相关行为的调查。结果共调查1010名移民,回收有效问卷1005份,知道当地有血吸虫病者占92.7%,了解患病原因是接触疫水者占78.1%;53.0%的调查对象家中喂养牲畜,75.0%直接使用人畜粪便灌溉农田,51.6%喂养牲畜的方式为放养。14.2%日常生活中有饮用生水的习惯,23.4%曾在江、河水中游泳、玩耍。男性接触钉螺、饮用生水及曾在江、河中游泳等危险行为发生率较女性高。结论湖北省引江济汉工程区移民对血吸虫病的认知率及相关行为正确率还有待提高。     

中国卫氏并殖吸虫线粒体基因组及多地域株的系统发育分析

目的　对福建省大、小囊蚴来源的两型卫氏并殖吸虫线粒体基因组序列进行比较和系统发育分析，探寻其可能存在的与表型相关的遗传特征。方法　以在福建省南平市延平区太平镇溪蟹中分离出的两种大小不同的囊蚴（直径分别为380～420 μm和320～340 μm）分别感染犬，收集犬粪及肺部虫卵及成虫。比较两种来源虫卵大小及外形差异；抽提两型并殖吸虫成虫基因组DNA，扩增并获得线粒体全基因组序列，进行序列结构及系统发育关系分析。结果　大、小囊蚴分别感染犬后，所获得的成虫体肥厚，具口、腹吸盘，腹吸盘位于体中线稍前，可见睾丸、卵巢和卵黄腺等结构，固定后呈椭圆形，长宽比约为1.7∶1。两组卵在长、宽上均有显著性差异，大囊蚴感染后所获虫卵亦较大。两组成虫和卵形态特征及ITS2基因序列符合卫氏并殖吸虫特征。成虫线粒体基因组序列分析显示，大、小囊蚴来源的成虫线粒体基因组蛋白编码区序列基本一致，主要差异区域位于前非编码区。滑动窗口分析显示，不同地域来源的卫氏并殖吸虫线粒体基因组间，多态性最大区域位于ND4基因内。系统发育分析表明，两型并殖吸虫均聚入卫氏并殖吸虫中国地域分支，与韩国/日本株关系较近，与（东）南亚株遗传距离较远。结论　中国福建大、小囊蚴来源的两型卫氏并殖吸虫在线粒体基因组水平上遗传距离较近，未表现出明显分化，但非编码区突变和结构变化可能影响了两者在表型上的差异。此外，线粒体各编码基因的进化速率存在明显差异，提示在进行系统发育等相关研究时，应注意选择合适的分子标记。     

日本血吸虫酚氧化酶诱导免疫对小鼠保护性的初步研究

目的观察日本血吸虫酚氧化酶的抗原性和诱导宿主抗血吸虫病的免疫保护性作用。方法将含酚氧化酶的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后,分别在两侧切取胶宽约1cm进行酶染色,然后准确切下相应的未染色的凝胶。经真空冷冻干燥机冻干后碾成粉末,高速电动匀浆成浆糊状,冷浸过夜。高速离心得上清即为日本血吸虫酚氧化酶粗抗原。设立3组进行保护性免疫实验A组(实验组)、B组(佐剂对照组)和C组(空白对照组)。初次免疫后第2、4周,各重复1次加强免疫,最后1次免疫后10d按常规收集各组免疫血清。常规ELISA法测定免疫血清效价。然后用新鲜逸出尾蚴(40±1)条/鼠进行攻击感染。6周后,收集成虫计数,常规计算减虫率并检测肝脏虫卵负荷。结果ELISA法测定的酚氧化酶免疫小鼠血清效价在1∶1200以上。日本血吸虫酚氧化酶粗抗原免疫小鼠,其雌虫、雄虫和总虫数的减虫率分别为53.27%、26.76%和39.53%,与C组相比,差异均有极显著意义(P<0.01)。A组减卵率为50.75%,与C组相比,差异有极显著意义(P<0.01)。结论日本血吸虫酚氧化酶具有抗原性,能诱导宿主抗血吸虫感染免疫保护作用。其诱导保护性免疫的机制尚待进一步研究。     

血吸虫感染新模型兔血清对童虫的体外杀伤实验

目的　在已建立的一种血吸虫感染伴随免疫新模型的基础上 ,观察该模型兔血清对童虫的体外杀伤作用 ,探讨该血清抗体在抗日本血吸虫感染保护性免疫中的作用。　方法　用倒置显微镜观察并比较不同稀释度的日本血吸虫感染伴随免疫新模型兔血清 (A血清 )与日本血吸虫感染常规模型兔血清 (B血清 )对体外培养童虫的杀伤作用 ,并经甲基蓝染色后计算童虫死亡率。　结果　对体外童虫的杀伤作用 ,新模型兔血清随浓度的降低而逐渐减弱 ,血清浓度越低 ,童虫死亡率亦越低。但常规模型兔血清随浓度的降低则呈现先上升后下降的趋势 ,以 1/ 10左右稀释度时最高。比较A、B两种血清对童虫的杀伤作用 ,前者强于后者 ,1/ 2血清稀释度培养 48h观察到的童虫死亡率分别为 (4 1.2 3±1.0 8) %和 (2 7.2 7± 2 .86) % (P <0 .0 5 ) ;先加入后者 4h后再加入前者能部分抑制前者的杀童虫作用 ,童虫死亡率为(3 7.63± 2 .3 3 ) % ,介于两者之间。常规模型血清组部分童虫体表出现膜状或泡状物质包绕 ,但童虫却未受到明显杀伤。结论　日本血吸虫感染伴随免疫新模型兔血清在体外对童虫的杀伤作用强于常规模型兔血清 ,推测前者可能以杀伤抗体占优势 ;而后者可能以封闭抗体占优势。     

血吸虫超微结构与免疫

血吸虫生活史复杂,从尾蚴侵入皮肤在人体内寄生开始,经历童虫、成虫、虫卵阶段。为了适应宿主的内环境得以生仔,虫体的超微结构随之发生相应变化,这些不断变化的结构给血吸虫免疫机制的研究增添了难度。血吸虫各期虫体既具有共同抗原,也具有各自特异性抗原,它们在血吸虫的免疫诊断、免疫病理或诱导宿主的保护性免疫方面均具有重要作用。血吸虫免疫机制复杂,相关知识尚不完全清楚。对于血吸虫超微结构的研究,不仅可揭示虫体发育的形态学变     

酚酶抑制剂对日本血吸虫感染小鼠抗再感染的影响

目的观察雌虫酚酶活性被抑制后,日本血吸虫成虫诱导感染小鼠的伴随免疫作用.方法每只小鼠初次感染日本血吸虫尾蚴(40±1)条,42 d后攻击感染(40±1)条尾蚴,其间初次感染21 d开始,按300 mg/kg的剂量隔日1次腹腔注射丙烯基硫脲,至攻击感染后20 d剖杀小鼠.同时设立实验对照组(未注射丙烯基硫脲组),初次感染对照组及攻击感染对照组.计算各组减虫率并进行统计学处理.结果实验组和对照组减虫率分别为86.4%和36.8%.经χ2检验差异有非常显著意义(χ2=10.7,P<0.01).两组检获虫体总数分别为28.9±10.2和34.8±14.2.经t检验差异也有显著意义(t=1.785,P<0.05).结论日本血吸虫酚酶活性被抑制后,虫卵卵壳形成被抑制,雌虫不能产出正常虫卵或虫卵不能发育成熟.依此建立的新模型提示,无可溶性虫卵抗原(SEA)存在,成虫能诱导小鼠更强的抗再感染作用.