日本血吸虫生长激素诱导的跨膜蛋白(GHITM)基因克隆与表达

<正>目的:课题组前期研究已经筛选出日本血吸虫肺期童虫的差异基因-生长激素诱导的跨膜蛋白(GHITM)基因,其可能在日本血吸虫的生长发育中起关键作用。本文克隆、表达GHITM基因,以便进一步探索其在血吸虫生长发育过程中的作用。方法:根据GHITM基因的序列,分别设计含有酶切位点的GHITM基因引物,以日本血吸虫成虫的总RNA为模板进行RT-PCR,PCR产物提纯后使用EcoR I和XhoI双酶切,然后与使用同样酶双酶切的pET-28a-c质粒连接并转化DH5α宿主菌,使用卡那霉素筛选阳性克隆后测序。     

日本血吸虫钙连蛋白(Canx)基因克隆与表达

<正>目的:钙连蛋白(Canx)在蛋白质合成中起重要作用,存在于内质网中需Ca2+的凝集素样分子伴侣蛋白,可与新合成的尚未折叠完全的蛋白质的寡糖链结合,防止蛋白质彼此聚集和泛素化,避免折叠不完全的蛋白质离开内质网;同时也可促进其它伴侣蛋白与这些蛋白质结合,使其折叠完全。无论是曼氏血吸虫还是日本血吸虫,仅有与Canx相似的钙结合蛋白的研究报道。本文报道与宿主相关的日本血吸虫Canx基因的克隆、表达,为研究其功能奠定基础。方法:提取日本血吸虫成虫总RNA,逆转录得到cDNA。设计引物用常规PCR法扩增出Canx编码基因,在设计引物时,切除了含21个氨基酸的信号肽,     

日本血吸虫腺苷酸激酶-1与程序性细胞死亡蛋白-10基因的克隆表达及其在发育中表达的变化

目的:克隆、表达、定位日本血吸虫腺苷酸激酶-1(Schistosoma Japonicum Adenylate Kinase-1,SjAK1)及日本血吸虫程序性细胞死亡蛋白-10(Schistosoma Japonicum Programmed Cell Death-10,SjPCD10),为进一步研究其基因在生长发育中的功能奠定基础。方法:据SjAK1、SjPCD10基因完整开放阅读框(长度分别为594bp、651bp)分别设计并合成特异性引物,提取日本血吸虫成虫总RNA,RT-PCR获得cDNA,以cDNA为模板分别扩增SjAK1、SjPCD10目的基因片段,与载体pET28a质粒共同进行双酶切,连接、转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并测序鉴定后,抽提重组质粒,转化表达宿主菌BL21。PCR鉴定阳性重组克隆,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western Bloting检测表达结果,镍柱亲和层析纯化目的蛋白,BCA法定量目的蛋白;ATP荧光检测试剂盒检测重组SjAK1的活性。将目的蛋白分别免疫新西兰兔制备多抗,ELISA鉴定多抗效价。免疫组化法检测SjAK1和SjPCD10基因在日本血吸虫皮肤型童虫(30min)、肺型童虫(3天)、肝门型童虫(10天、14天、18天、22天)以及成虫(26天)中表达的变化。结果:成功构建重组表达质粒pET28-SjAK1和pET28-SjPCD10,原核表达的目的蛋白rSjAK1为可溶性、rSjPCD10呈包涵体形式;SDS-PAGE鉴定目的蛋白rSjAK1约26kDa、rSjPCD10约28kDa,与理论分子量一致;经镍柱亲和层析纯化获得高纯度目的蛋白,rSjAK1的比酶活为135.2U/mg。将目的蛋白免疫新西兰兔后血清效价均高于1∶1 280。免疫组化结果显示,SjAK1在各型童虫均有表达,皮肤型和肺型童虫中表达较少,肝门型童虫感染10天开始增加,但成虫期表达又减少;SjPCD10从18天开始表达增多,在雄虫和虫卵表达最为明显。结论:本实验成功克隆表达及纯化SjAK1、SjPCD10,其基因在日本血吸虫发育过程中均有表达,为深入研究其基因功能奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7紧密黏附素免疫保护性片段的基因克隆与表达

目的　克隆表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 5 7∶H7紧密黏附素 (intimin)免疫保护性片段 (intiminC30 0 )。方法　设计引物采用PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC30 0 ,T A克隆后构建原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测。结果　PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增出了约 2 80 0bp和 90 0bp的目的片段 ;原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0经酶切及测序鉴定与预期序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5 %和 30 %;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 96× 1 0 3和 35× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达。结论　EHECO1 5 7∶H7紧密黏附素免疫保护性片段经基因克隆后获得了较高的表达量 ,为进一步的生物学性质及免疫学特性研究奠定了基础。