SH2A 基因对细胞信号转导的影响及其亚细胞定位

目的 研究Src同源域2(src homology 2，SH2)A基因在细胞信号转导中的作用并进行亚细胞定位。方法 通过RT—PCR方法扩增SH2A cDNA编码序列，构建真核重组表达载体pcDNA3．1-SH2A，利用脂质体转染肝癌Bel7402细胞、COS7细胞，检测蛋白酶C(protein kinaseC，PKC)、酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)、丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)活性的改变；另构建pEGEP—SH2A，转染同前，荧光显微镜观察荧光定位。结果 测序结果显示真核重组表达载体pcDNA3．1-SH2A及pEGFP—SH2A中均含有SH2AcDNA编码序列；肝癌Bel7402细胞、COS7细胞转染pcDNA3．1-SH2A后，胞浆PKC的活性下降了40％左右，MAPK和TPK活性未见明显改变。荧光显微镜观察发现SH2A基因在细胞质中表达。结论 SH2A基因编码蛋白在PKC信号转导通路中起抑制作用；SH2A基因编码蛋白定位于细胞质。     

小分子干扰RNA诱导卵巢上皮性癌细胞凋亡的实验研究

表皮生长因子受体2（HER-2）是HER-2原癌基因编码的一种酪氨酸蛋白激酶，研究表明，过度表达的HER-2基因通过激活瑚等信号分子，导致细胞过度增殖和恶性变，抑制细胞凋亡，与肿瘤的恶性程度和转移能力密切相关。已有研究证明，30％的卵巢上皮性癌（卵巢癌）存在HER．2基因的高表达。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是生物进化过程中保留的一种防御机制，可以介导互补基因的靶向性降解。本研究拟应用RNAi技术，合成针对HER-2基因的特异性小分子干扰RNA（small interference RNA，siRNA），转染卵巢癌细胞株SKOV3细胞，探索siRNA诱导卵巢癌细胞凋亡的机制。     

曲古抑菌素A对神经胶质瘤细胞NOS1基因转录的影响

目的 以曲古抑菌素A(TSA)为乙酰化作用因素,研究大鼠神经胶质瘤C6细胞中乙酰化对神经型一氧化氮合酶(NOS1)基因转录水平的影响.方法 应用real-time RT-PCR方法检测C6细胞中NOS1基因mRNA在不同时间及不同浓度TSA作用下表达水平的变化;采用nuclear run-off实验检测TSA作用下NOS1基因转录效率的改变.结果 TSA以时间及浓度依赖方式上调C6细胞中NOS1 mRNA水平;NOS1基因转录效率在TSA作用下显著提高.结论 TSA引起的乙酰化使C6细胞中NOS1基因转录水平明显增加.     

G蛋白β3<\sub>亚单位825C／T多态性与原发性高血压关系的多因素分析

近年来,关于GNB3基因825C/T单核苷酸多态性（SNP）与原发性高血压（EHT）关系研究所得到的结论不一,因此两者的关系尚未确定;已进行的研究多局限于单纯地分析SNP与高血压的关系方面,没有考虑到其他因素的影响及混杂因素的控制。本研究从遗传学和流行病学两方面入手,在考虑多因素共同作用的基础上来分析GNB3基因825C/T SNP与EHT的发生是否有关。     

HER-2基因沉默对卵巢癌细胞体外增殖能力的影响

目的体外转录合成HER-2siR-NA,转染卵巢癌细胞,检测其对细胞生长增殖能力的影响。方法采用real-timePCR检测HER-2mRNA表达情况,采用细胞计数及MTT绘制细胞生长曲线及检测细胞增殖率的变化,并同时采用TUNEL法检测细胞凋亡形态学的变化。结果特异性干涉组细胞HER-2基因的表达水平明显下降,real-timePCR结果显示在干涉后第3天及第6天,特异性干涉组与非特异性干涉组及空白对照组相比,差异有统计学意义,P值均为0.000;而非特异性干涉组与空白对照组之间相比,差异无统计学意义,P值分别为0.653和0.522。特异性干涉组细胞的增殖能力在48、72及96h不同时间点与非特异性干涉组及空白对照组相比,差异均有统计学意义,P值分别为0.023、0.000和0.030。TUNEL结果显示,特异性干涉组出现细胞胞质浓缩,胞核浓聚致密的斑点状,大小不一,形成凋亡小体。结论体外转录合成的HER-2siRNA能特异抑制HER-2基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,siRNA有望成为卵巢癌分子靶向治疗的一个新工具。     

白细胞中血管紧张素原mRNA的定量分析

目的：检测白细胞中血管紧张素原（ＡＧＴ）ｍＲＮＡ的量。方法：提取总ＲＮＡ,进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交;应用ＲＴ－ＰＣＲ技术联合印迹杂交和同位素掺入法对微量ｍＲＮＡ检测。结果：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交显示肝细胞血管紧张素原ｍＲＮＡ有明显的杂交带,而白细胞无杂交信号。将ＲＴ－ＰＣＲ技术同印迹杂交或同位素掺入法联合应用能提高血管紧张素原微量ｍＲＮＡ检测灵敏度。结论：白细胞的ＡＧＴｍＲＮＡ量低于肝细胞;ＲＴ－ＰＣＲ联合印迹杂交或同位素掺入法是微量ｍＲＮＡ定量分析的有效方法。     

神经型一氧化氮合酶在缺血预适应中的作用及其机制研究

目的 建立化学模拟缺血预适应的细胞模型,研究缺血预适应过程中神经型一氧化氮合酶(nNOS)的作用及其机制.方法 用300 μmol/L CoCl2预处理SK-N-SH细胞3 h.24 h后以无血清培养基培养细胞,建立缺血预适应的细胞模型,同时应用nNOS特异性抑制剂7-NI,研究nNOS在缺血预适应中的作用.在缺血预适应后不同时段以MTT法测定细胞增殖情况,流式细胞技术测定细胞凋亡情况,并与无血清刺激组进行比较;同时以RT-PCR技术检测nNOS和凋亡相关基因在缺血预适应后的表达情况.结果 300 μmol/L CoCol2预处理可以使细胞在无血清培养条件下的增殖能力较无血清刺激组增加2.5倍,同时使细胞凋亡减少70%,与无血清刺激组比较差异均有统计学意义(P<0.05).缺血预适应可在3 h和24 h上调nNOS的表达,同时上调凋亡抑制基因Bcl-2的表达,下调凋亡促进基因Apaf-1的表达.而这些调节作用可被nNOS抑制剂7-NI抑制.结论 300 μmol/LCoCl2预处理SK-N-SH细胞3 h可以模拟缺血预适应的保护作用.nNOS在缺血预适应中可调节Bel-2和Apaf-1基因的表达从而起到重要的作用.     

高钾饮食对大鼠肾脏WNK1不同转录本表达的作用及其意义

背景 WNK1是新近发现的肾脏多个离子转运体及通道的调控蛋白,与醛固酮离子转运途径有关.目的 探讨高钾饮食致体内醛固酮增高对大鼠肾脏WNK1不同转录本表达的作用及其意义.方法 采用高钾饮水饲养Wistar大鼠8只,检测血清、24 h尿液离子质量浓度及血清醛固酮质量浓度.半定量RT-PCR方法 检测大鼠肾脏WNK1-L和WNK1-KS基因表达情况.结果 与正常对照组(n=8)比较,高钾组(n=8)血清醛固酮水平显著升高[(1.86±0.66)比对照组:(0.25±0.04)μg/L,P<0.01],为对照的7.4倍.血清及尿液钾离子和尿液氯离子质量浓度升高(P<0.05),尿液钠离子质量浓度下降(P<0.05),血清钠离子和氯离子无差异(P>0.05).高钾组WNK1-L表达量无差异(0.27±0.07比0.26±0.07,P>0.05),WNK1-KS表达量显著上升(1.60±0.22比0.38±0.08,P<0.01).结论 高钾饮食导致大鼠醛固酮质量浓度升高,醛固酮可通过调控WNK1-KS表达起到排钾保钠的生理作用.     

2,3,7,8-四氯二苯-对-二噁英对BRL-3A细胞增殖、凋亡及胰岛素样生长因子2表达的影响

目的探讨2,3,7,8-四氯二苯-对-二噁英(TCDD)对大鼠肝BRL-3A细胞增殖、凋亡以及胰岛素样生长因子2(IGF2)表达的影响。方法培养BRL-3A细胞,TCDD 5,10,15和20 nmol.L-1作用24 h,MTT法检测细胞存活。BRL-3A细胞紫外线照射2 min或经无血清培养后,加入TCDD 10 nmol.L-1,流式细胞计数方法检测细胞凋亡。荧光定量PCR方法检测TCDD 10 nmol.L-1对BRL-3A细胞Igf2 mRNA表达的影响,Western印迹法检测IGF2蛋白表达。结果 TCDD 5,10,15和20 nmol.L-1作用24 h,BRL-3A细胞的存活率分别为(107.3±0.9)%,(122.6±1.2)%,(115.2±0.4)%和(112.3±1.1)%,明显高于正常对照组(P<0.05),TCDD 10 nmol.L-1对BRL-3A细胞增殖促进作用最强。紫外线照射2 min的溶剂对照组BRL-3A细胞的凋亡率为(26.4±5.0)%,加入TCDD 10 nmol.L-1细胞凋亡率明显降低为(12.2±3.2)%(P<0.05);无血清培养的溶剂对照组72和120 h BRL-3A细胞的凋亡率分别为(49.6±7.6)%和(51.6±9.1)%,加入TCDD 10 nmol.L-1组的细胞凋亡率显著降低,分别为(22.0±5.1)%和(31.0±5.5)%(P<0.05)。与溶剂对照组相比,TCDD 10 nmol.L-1组Igf2基因的表达随作用时间逐渐增高,TCDD作用24 h细胞Igf2 mRNA的表达增加了1.67倍,蛋白的表达增加了2.6倍(P<0.05)。结论 TCDD具有刺激BRL-3A细胞增殖和抑制该细胞凋亡的作用;TCDD可能通过上调BRL-3A细胞中IGF2的表达,调节细胞的增殖和凋亡。