HCV感染人LDLR转基因小鼠肝癌细胞的初步研究

近年来在研究HCV与易感细胞的相互作用中发现 ,血清中的HCV颗粒是与 β 脂蛋白或IgG结合形成复合物(HCV RNAcarryingmaterial,HCVrcm ) ,HCVrcm通过与细胞表面的脂蛋白受体分子结合进入细胞 ,这种复合物的形成有利于HCV与靶细胞的结合和HCV的持续感染。人低密度脂蛋白受体(hLDLR)是一种表达在细胞表面的脂蛋白受体分子 ,是HCV感染细胞的重要受体 ,它在介导LDL进入细胞的过程中同时将HCV带入胞内。HCV能感染人的肝脏细胞 ,但是不能感染小鼠的肝脏细胞 ,分析可能原因是小鼠的肝脏细胞表面的小鼠低密度脂基金项目 :国家自然科…     

T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA的方法

目的：建立一种应用T7 RNA聚合酶体外转录合成大量siRNA的方法。方法：以萤火虫荧光素酶为靶标，应用T7 RNA聚合酶体外转录合成siRNA，脂质体转染法将其导入HepG2细胞中，通过测定荧光素酶的量，评价siRNA对萤火虫荧光素酶基因表达的抑制作用。结果：合成了以萤火虫荧光素酶为靶标的siRNA，合成的siRNA能特异性地抑制荧光素酶基因的表达，抑制率为80％。结论：建立了一种经济简便的体外合成siRNA的方法。     

脂联素对刀豆球蛋白A诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用

目的探讨脂联素(ADPN)是否对肝脏的免疫性损伤具有保护作用以及可能的作用机制。方法将小鼠ADPN基因高效表达载体导入小鼠体内,获得高血清ADPN模型小鼠(表达载体组),与导入空载体的对照小鼠(空载体组)同时静脉内注射刀豆球蛋白A(Con A),以诱导肝脏的免疫性损伤,测定不同时间点血清ALT浓度,并进行肝组织病理学检查(HE染色),观察两组小鼠肝脏损伤程度是否有差异。比较两组间血清TNFα浓度的不同,探讨可能的作用机制。结果表达载体组小鼠注射Con A后血清ALT水平的升高明显低于空载体组,差异有统计学意义(P<0.01),组织学检查也显示表达载体组小鼠的肝损伤明显低于空载体组。经统计分析表明,ALT水平与血清ADPN水平成负相关(r=-0.5034,P=0.0121)。表达组小鼠血清TNFα水平明显低于空载体组(P<0.01)。结论脂联素对Con A诱导的肝脏免疫性损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制TNFα的产生进而阻断肝细胞遭受免疫性攻击有关。     

腺病毒转染法构建表达乙型肝炎病毒核心蛋白小鼠肝癌细胞系及其在乙肝疫苗评价中的应用

目的 构建一种可高效表达乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)核心蛋白(HBc)C57BL/6小鼠来源肝癌细胞系,并以其作为靶细胞评价乙肝基因疫苗在C57BL/6小鼠体内所引起的HBc特异性细胞毒性T细胞(CTL)的活性.方法 以HBV全基因组为模板,采用PCR方法扩增HBc基因,插入AdEasy腺病毒穿梭载体,构建携带HBc蛋白的腺病毒穿梭载体AD-HBc,电转携带有腺病毒骨架质粒(Ad-Easy)的E.coli BJ5183感受态细胞,获得重组腺病毒质粒AD-CMV-HBc,经PmeⅠ线性化处理后转染HEK293细胞进行包装得到相关的重组腺病毒,再感染C57BL/6小鼠来源肝癌细胞系Hepa1-6.结果 成功构建表达HBc蛋白的重组腺病毒,在体外对Hepa1-6细胞的感染率几乎为100％,并且HBc蛋白得到高效表达.以此为靶细胞用于pVAX1-HBc基因疫苗免疫C57BL/6小鼠产生的CTL活性的体外检测.结论 我们成功构建HBc蛋白表达的靶细胞系,对研究乙肝病毒核心抗原(HBcAg)所引起的细胞免疫反应及乙肝发病机理等方面有重要意义.     

聚合酶链反应检测SEN病毒D和H亚型方法的建立及比较

SEN病毒(SENV)是新近发现怀疑与输血相关的non-A-E型肝炎有关的一种病毒.我们实验室首次证实在我国也存在SENV感染[1],为进一步了解其致病性,我们在前期工作的基础上,参考已发表的文献[2]及基因序列,建立了两种特异性检测SENV-D和SENV-H的套式PCR方法.     

水动力转染技术及其在肝炎病毒实验动物模型研究中的应用

水动力转染方法是指从小鼠尾静脉快速注射大体积含目的基因的生理盐水,从而实现外源基因在小鼠体内(尤其是肝脏内)的高效表达.它作为一种快速、简单、高效、安全的外源基因转染方法,已经广泛用于体内基因功能、基因调节、蛋白表达和基因治疗等方面的研究.由于该方法转染的目的基因主要在小鼠体内肝脏获得高水平表达,特别适用于肝炎病毒功能基因小鼠体内表达模型的建立.利用该技术建立的肝炎病毒实验动物模型有助于促进肝炎病毒致病机制的研究以及抗病毒药物的体内筛选与评价.     

丙型肝炎病毒与宿主蛋白相互作用研究进展

宿主蛋白在丙型肝炎病毒(HCV)的复制、翻译以及致肝脏病变等过程中发挥着重要作用,本文就宿主蛋白与HCV 5′非编码区、3′编码区以及结构蛋白(核心蛋白C、包膜蛋白E1、E2)、非结构蛋白(NS3、NS4、NS5A和NS5B)之间的相互作用进行综述。     

切刻内切酶介导恒温扩增技术条件优化

目的 采用切刻内切酶介导恒温扩增技术(nicking enzyme mediated isothermal amplification,NEMA)扩增蜡样芽孢杆菌质粒,考察缓冲体系、温度、离子浓度等条件对扩增效率的影响.方法 通过独特的引物设计,采用NEMA技术扩增蜡样芽孢杆菌质粒,通过系列实验优化了缓冲体系、温度和离子浓度等条件,采用琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果.结果 通过设计不同长度片段的扩增产物,证明采用NEMA技术进行恒温扩增引物设计的正确性.扩增反应中,缓冲体系的组成、扩增温度、体系镁离子及二甲基亚砜(DMSO)的浓度会影响切刻内切酶恒温扩增效率,而海藻糖添加与否在本实验中与扩增效率无关.在最优条件下,NEMA恒温扩增方法对于蜡样芽孢杆菌质粒的灵敏度达到1.7 pmol/L.结论 NEMA可以用来进行较长片段的扩增,有望成为一种常规的恒温扩增技术,应用到战时或者应急条件下的快速核酸诊断中.     

不同表面化学修饰金纳米棒的血液相容性

目的 采用化学修饰获得不同表面功能基团、不同电性质金纳米棒(GNR),考察其血液相容性差异.方法 采用“种子调制生长法”制备GNR,对其表面进行化学修饰得到电中性的聚乙二醇(PEG)修饰GNR(PEG-GNR)、带负电的巯基十一烷酸(MUA)修饰GNR(MUA-GNR)及带正电溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)修饰GNR(CTAB-GNR).采用透射电镜、表面等离子共振及zeta电位测量对修饰前后的GNR进行表征.通过溶血实验及血浆复钙实验评价3种不同电性质、不同化学修饰GNR的血液相容性.结果 3种不同化学修饰GNR对血液中红细胞的破坏程度依次为:PEG-GNR＜ CTAB-GNR＜ MUA-GNR.PEG-GNR在较高剂量1.7 g/L时,溶血率已小于5％.血浆复钙实验结果表明,相同剂量的3种修饰中,CTAB-GNR的复钙时间动力学曲线明显由陡峭趋于平缓,且复钙时间延长最多(33 min),其次为PEG-GNR(21 min).结合产生丝状不溶物的量可知,PEG修饰的GNR具有最佳的抗凝血性能.结论 综合溶血实验及血浆复钙实验结果可认为,表面PEG化能显著改善GNR材料的血液相容性.