FSHR胞外区基因片段的原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建人卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区的原核表达载体,并用纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备抗血清.方法 采用RT-PCR克隆人FSHR胞外区,将其克降到原核表达载体pET32a(+),并通过IPTG诱导目的 基因在大肠杆菌中表达,所获得的包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化重组蛋白,并用SDS-PAGE和蛋白印迹法鉴定.结果 PCR扩增出1 047 bp目的 基因片段,测序证实克隆的基因序列与GenBank中的FSHR序列相符.工程菌pET32 a(+)/FSHR胞外区经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr约为58 000,与预期的一致.其表达形式为不溶性包涵体,此包涵体蛋白通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,纯化的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带.该蛋白免疫小鼠制备抗血清,抗体效价为1:12 800,Western blot检测证实该抗体能与目的 蛋白发生特异性结合.结论 获得了人FSHR胞外区融合蛋白及特异性多克隆抗体,为进一步研究FSHR蛋白的功能奠定了基础.     

基于Eppin优势中和B细胞表位的新型DNA避孕疫苗的制备和鉴定

目的制备基于Eppin优势中和B细胞表位的新型DNA避孕疫苗。方法采用PCR技术扩增mIL-4和Eppin B细胞表位基因,将其克隆到真核表达载体pVITR02-mcs,构建双盒表达载体,并将双盒表达质粒转染CHO细胞,检测其体外表达;将双盒表达质粒DNA与具有穿膜活性的HIV-1 TAT49-57阳离子肽,通过正负电荷吸引原理,制备成模拟病毒颗粒样的疫苗,并以DNA阻滞试验、DNaseⅠ保护试验和扫描透射电镜对该疫苗进行鉴定。结果 RT-PCR和免疫印迹结果表明转染细胞中均有目的分子的存在,在电荷比为4的条件下,该疫苗能形成类似病毒样的颗粒。结论成功制备了基于Eppin优势中和B细胞表位的模拟病毒颗粒样疫苗,为进一步研究避孕效果奠定了基础。     

人Izumo蛋白的二级结构及B细胞抗原表位预测

目的:预测人Izumo蛋白的二级结构及B细胞抗原表位.方法:以人Izumo基因序列为基础,按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplus-Schulz方法预测Izumo蛋白骨架区的柔韧性;按Kyte-Doolittle方法预测其亲水性、Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数.结果:Chou-Fasman及Gamier-Robson两种方法预测的结果均表明,Izumo蛋白含较多的α螺旋,蛋白第6～17、30～40、88～99、103～120、153～160、173～188、249～260、283～297、334～338和339～346区段可能是α螺旋中心,第21～25、198～200、245～248和320～323区段可能是β折叠中心.用Kyte-Doolittle、Emini和Jameson-wolf方法分别对Izumo蛋白B细胞抗原表位进行预测结果表明,蛋白质第36～42、62～66、94～99、118～122、129～132、151～154、161～164、173～177、205～208、212～216、256～265、271～276、283～288、314～318和336～350区段附近很可能为B细胞表位优势区域.结论:该研究结果有助于确定Izumo蛋白的B细胞优势表位及发挥免疫避孕的活性部位.     

FSHR胞外区抗原的二级结构预测和B细胞表位预测

目的:分析卵泡刺激素受体(Follicle stimulating hormone receptor,FSHR)胞外区蛋白的二级结构,在线预测FSHR胞外区潜在的B细胞表位.方法:利用DNAStar Protein软件对FSHR胞外区蛋白的二级结构和表面特性进行分析,联合在线B细胞表位预测,预测FSHR胞外区蛋白可能的抗原表位.合成预测的B细胞表位肽,对其抗原性进行鉴定.结果:FSHR胞外区蛋白可能的抗原表位区域为17～34、4244、116～122、142～147、179～193、239～241、266～270、279～282、288～307.选择4个区域合成肽段表位区域能与免疫抗血清发生抗原特异性反应.结论:应用多参数成功预测了FSHR胞外区蛋白抗原的B细胞表位.     

胸腺肽 α1 体外刺激胃癌患者外周血单个核细胞对淋巴细胞亚群影响

目的 观察胸腺肽α1(thymosin α1,Tα1)体外刺激培养胃癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)对淋巴细胞亚群分化及分泌细胞因子谱的影响,分析Tα1对肿瘤患者免疫功能的影响. 方法 分离32例胃癌患者及18例健康自愿者PBMCs,50、10、1 μg/ml Tα1体外刺激培养2 d;流式细胞仪检测CD4+、CD8+、CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞百分比、CD4+/CD8+变化及分泌Th1/Th2细胞因子谱变化. 结果 Tα1体外刺激PBMCs后,胃癌患者及健康自愿者的CD4+、CD8+ T细胞水平及CD4+/CD8+比值均无明显变化;健康自愿者CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞水平无明显变化,胃癌患者CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞水平明显提高(P<0.05);1 μg/ml Tα1促进胃癌患者PBMCs分泌IL-1β、TNF-α,10 μg/ml促进胃癌患者PBMCs分泌IL-6(P<0.05),健康自愿者PBMCs分泌细胞因子谱变化不明显(P>0.05). 结论 Tα1体外刺激胃癌患者PBMCs,提高CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞亚群水平,可能对肿瘤患者抗肿瘤免疫起抑制效应.     

细胞编码microRNA在轮状病毒复制中的作用及其表达谱分析

目的研究细胞编码miRNA在轮状病毒复制中的作用,并分析轮状病毒感染对于细胞编码miRNA种类及表达的影响,结合预测初步寻找具有重要功能的单个miRNA。方法首先,利用RNAi技术成功干扰MA104细胞中miRNA生成必须的Dicer酶,利用FFA法比较Dicer干扰组与阴性对照组感染后子病毒的滴度。然后,利用miRNA微芯片技术分析MA104细胞在2株轮状病毒SA11与Wa株感染后miRNA表达变化,通过聚类分析研究变化规律。结果干扰组MA104细胞的子病毒滴度显著增高。MA104细胞编码miRNA在2株轮状病毒感染后,约有200个miRNA有不同程度的变化。结合计算机预测,初步锁定miR-512-5p,miR-490,let-7c等10个miRNA可能在轮状病毒复制中具有功能。结论轮状病毒调节其感染细胞编码的miRNA的表达谱,反过来,细胞的Dicer及细胞编码miRNA影响轮状病毒复制。