SHP-2C459/S突变体在三氧化二砷诱导的HEK293T细胞凋亡中的作用

目的 观察三氧化二砷(As2O3)对293T细胞凋亡和增殖的影响并探讨SHP-2在其中的作用.方法 显性负性SHP-2突变体SHP-2C459/S与具有绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP-C1共转染人HEK293T细胞,Ho-echst33258染色检测细胞凋亡,细胞计数及荧光分光光度法检测细胞增殖.结果 SHP-2C459/S突变体能增强细胞凋亡和减轻增殖抑制.结论 SHP-2可能参与到As2O3诱导的细胞凋亡和增殖抑制的信号转导通路中.     

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2对Ang Ⅱ刺激的心肌成纤维细胞增殖的影响

目的: 探讨含有Src同源结构域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2 (Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2, SHP-2) 对血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ) 刺激的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的作用。方法: 差速贴壁法体外培养心肌成纤维细胞,以波形蛋白(vimentin)鉴定CFs纯度; MTT法检测Ang Ⅱ作用下心肌成纤维细胞增殖率,采用重组腺病毒过表达SHP-2和SHP-2抑制剂NSC-87877分别对Ang Ⅱ作用下的细胞增殖的影响。结果: Ang Ⅱ 对CFs增殖的促进作用有剂量依赖性,其促进细胞增殖的最高浓度为10^-7 mol/L;在AngⅡ 的刺激下,SHP-2可以促进心肌成纤维细胞增殖,并且突变体组比野生型组增殖更明显(P<0.01)。 SHP-2抑制剂NSC-87877达到50 μmol/L时可以明显抑制Ang Ⅱ刺激下的CFs增殖。结论: Ang Ⅱ的促CFs增殖作用是通过SHP-2调控的。     

SHP-2在三氧化二砷诱导HEK293T细胞凋亡中的作用

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用。方法将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞;在5μmol.L-1的As2O3孵育48 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot方法检测Cyt-C、Caspase-3、p-ERK、ERK、p-JNK及JNK的表达变化。结果5μmol.L-1As2O3可诱导HEK293T细胞凋亡,SHP-2能抑制其作用;SHP-2C459S突变体组Cyt-C和Caspase-3表达均高于空载体组,SHP-2野生型组则低于空载体组;SHP-2野生型组p-ERK表达高于空载体组,SHP-2C459S突变体组则相反;p-JNK的表达,SHP-2C459S突变体组高于空载体组,而SHP-2野生型组低于空载体组。结论SHP-2可抑制As2O3诱导的HEK293T细胞凋亡,其机制可能与激活ERK和抑制JNK途径有关。     

SHP-2重组腺病毒的包装及对心肌细胞的感染

目的 采用HEK293细胞包装Ad-GFP-SHP-2和Ad-GFP-SHP-2-E76A并扩增Ad-GFP重组腺病毒并感染乳鼠心肌细胞.方法 纯化两种载体;Pac Ⅰ酶切线性化;线性化的载体转染入HEK293细胞进行包装;从病变的HEK293细胞分离重组腺病毒.利用重组的腺病毒感染乳鼠心肌细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.结景 Pac Ⅰ酶切后,琼脂糖凝胶上显示有4.5 kb的条带;转染线性化的重组腺病毒载体人HEK293细胞中,反复冻融HEK293,其上清中含有重组腺病毒,当感染乳鼠心肌细胞感染复数为100时,感染效率大于90%.结论 成功包装重组腺病毒,包装后的腺病毒可高效感染乳鼠心肌细胞.     

SHP-2通过ERK和JNK通路调节PC12细胞应对NGF的细胞生存和凋亡

目的：探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在神经生长因子(NGF)作用下大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞生存及NGF撤除后细胞凋亡的过程中的作用及机制。方法：SHP-2 抑制剂NSC87877作用于PC12细胞, MTT测定PC12细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡率。将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体通过脂质体方法转染PC12细胞;加入NGF作用１h和撤除NGF 5 h后分别用Western blotting方法检测细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK（p-ERK）、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及磷酸化JNK (p-JNK)表达变化。结果：MTT和流式细胞仪检测表明SHP-2 可以促进PC12细胞生存,抑制细胞凋亡。Western blotting结果显示无SHP-2抑制剂组和转染pIRES-SHP-2野生型组p-ERK表达在加入NGF的过程中升高;撤除NGF后,各组p-ERK表达均降低,pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体组和pIRES-GFP组p-ERK表达明显低于pIRES-GFP-SHP-2野生型组, NGF去除+ SHP-2抑制剂组的表达水平明显低于NGF去除对照组; NGF去除+SHP-2抑制剂组p-JNK表达高于NGF去除对照组;pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体组高于pIRES-GFP空载体组,pIRES-GFP-SHP-2野生型组低于pIRES-GFP空载体组。结论：SHP-2可能通过对ERK的正向激活,抑制JNK的激活,增强NGF作用下PC12细胞生存及抑制NGF撤除后所致细胞凋亡,从而在NGF的信号转导中起到一个中心环节的作用。     

乳腺癌中雄激素受体表达与ER、PR、HER2、Ki67、EGFR的关系

目的 研究乳腺癌中雄激素受体(androgen receptor,AR)的表达与雌激素受体(estrogen recep-tor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth receptor 2,HER2)及Ki67、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达的关系.方法 用免疫组织化学染色方法评估1069例乳腺癌患者的AR、ER、PR、HER2、Ki67和EGFR的表达,并分析AR表达与ER、PR、HER2、Ki67及EGFR表达的关系.同时分析AR表达与临床情况如患者年龄、肿瘤大小、肿瘤类型、肿瘤分级等的关系.结果 AR阳性表达率为77.36％,ER阳性表达率为60.99％、PR阳性表达率为61.18％,且AR的表达与ER、PR的表达(P ＜0.0001)、肿瘤大小(P =0.0139)及低增殖指数(P =0.0002)有关,与EGFR无关.在AR +/ER-组,AR表达与HER2(P=0.0375)、肿瘤大小(P=0.0460)及低Ki67表达(P=0.0111)有关;在AR +/PR-组,AR表达与低Ki67表达(P =0.0283)相关;在HER2-组,AR与低Ki67表达(P＜0.0001)有关.结论 AR可作为乳腺癌个体化治疗的新靶点.     

糖原合成激酶3β对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响

目的 研究糖原合成激酶3β(GSK3β)在骨肉瘤侵袭、转移中的作用。方法 通过Western blot法检测骨肉瘤患者肿瘤组织及骨肉瘤细胞中GSK3β的表达和磷酸化水平;使用两种GSK3β小分子抑制剂处理骨肉瘤细胞,通过细胞迁移及侵袭实验检测GSK3β活性受抑制对骨肉瘤细胞迁移、侵袭的影响。结果 GSK3在骨肉瘤细胞中过表达且存在活性调节异常;在转移及非转移骨肉瘤患者肿瘤组织中均可检测到GSK3表达及活性异常,尤其在转移的骨肉瘤患者肿瘤组织中;抑制内源性GSK3活性,明显降低肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。结论 GSK3β促进骨肉瘤细胞的侵袭、迁移,可能为骨肉瘤的临床治疗开辟潜在的靶点奠定理论基础。