重组金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 的表达及生物学活性分析

目的 克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因,添加亲和纯化标签进行原核表达,并对表达产物进行生物学活性分析.方法 通过PCR从pGEM-T-SEC2质粒中亚克隆得到带有编码6个组氨酸的核苷酸序列的基因片断,构建了表达质粒pET-28a-SEC2,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达.利用亲和层析纯化rSEC2,并采用MTT法对纯化后的rSEC2和天然SEC2生物学活性进行研究和比较.结果 表达质粒pET-28a-SEC2通过测序,表明已连入正确表达目的蛋白的核苷酸序列.含有该质粒的表达菌株经IPTG诱导,产生约占菌体总蛋白40%的可溶性重组蛋白.SDS-PAGE显示,经Ni2 亲和柱纯化的目的蛋白达到了电泳纯.MTT法表明该rSEC2和天然SEC2均有显著的超抗原活性.结论 成功构建了pET-28a-SEC2表达质粒,获得了与天然SEC2有着类似超抗原活性的高纯度rSEC2,为进一步研究该蛋白的抗肿瘤活性奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌肠毒素SEC2的纯化与活性研究

从金黄色葡萄球菌发酵液中纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2（SEC2）。发酵液经超滤浓缩、硫酸铵沉淀、阴离子交换色谱和分子筛色谱，获得了纯度为90％的SEC2，总收率23％。体外刺激脾淋巴细胞增殖实验以及体外肿瘤细胞增殖抑制试验表明该蛋白具备良好的超抗原活性。     

野生型金黄色葡萄球菌肠毒素C2在E.coli中的表达和纯化研究

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因在E.coli重组表达,纯化重组SEC2(rSEC2)并进行生物学活性分析。方法PCR获得正确编码SEC2的基因片断,构建表达质粒pET-28a-sec2在E.coliBL21中表达。利用离子交换和分子筛色谱纯化rSEC2,四甲基偶氮唑盐(MTT)法对rSEC2和天然SEC2(nSEC2)生物学活性进行分析和比较。结果可溶性rSEC2占菌体总蛋白质的40%,两步纯化后蛋白质纯度约达95%,rSEC2和nSEC2均具有显著的超抗原活性。结论成功获得与nSEC2有着类似活性的高纯度rSEC2,为进一步研究该蛋白质的抗肿瘤机理奠定物质基础。     

表达rhTNFR-Fc的CHO细胞的氨基酸代谢特征及氨基酸流加培养工艺研究

为提高表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(rhTNFR-Fc)的CHO工程细胞的培养密度和目的蛋白表达,研究了葡萄糖和谷氨酰胺流加-批式培养工艺的细胞氨基酸代谢特征及游离氨基酸和大豆蛋白水解物的补加策略.通过补加葡萄糖和谷氨酰胺浓缩液分别维持其浓度为10 mmol/L和2 mmol/L左右,在不同阶段定期补加特定的氨基酸浓缩液或大豆蛋白水解物补充氨基酸消耗,检测细胞培养上清中rhTNFR-Fc的表达.谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸等4种非必需氨基酸快速消耗,是CHO工程细胞增殖和目的蛋白表达的限制性底物.以游离氨基酸、游离氨基酸合并大豆蛋白水解物补充氨基酸消耗可分别使细胞生长密度提高50%、100%,目的蛋白表达增加60%、125%,培养时程延长44%、66%,同时葡萄糖比消耗率、乳酸比生成率降低,谷氨酰胺的利用效率提高.     

金葡菌肠毒素C2的克隆表达及其生物学活性

目的克隆金葡菌肠毒素C₂全长基因，构建SEC₂的表达载体，实现其可溶性表达，并对纯化的rSEC₂蛋白的生物学活性进行研究。方法通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)从金葡菌FRI1230菌株基因中得到肠毒素SEC₂的基因，将其克隆至融合表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌进行表达并对融合蛋白进行亲和色谱纯化。通过考察重组SEC₂对淋巴细胞的增殖作用及其对肿瘤细胞杀伤活性的影响，对其超抗原活性和免疫学活性进行研究。结果得到正确的肠毒素SEC₂基因序列并得到高效表达的融合蛋白，MTT法结果表明，重组SEC₂表现出良好的促淋巴细胞增殖活性，且能够增强淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结论本研究成功克隆了SEC₂基因，表达并纯化出具有抗肿瘤生物学活性的重组SEC₂蛋白，为进一步对其分子抗肿瘤作用机制进行研究以及构建靶向抗肿瘤融合蛋白奠定了基础。     

高效亲和色谱法检测细胞培养上清中的抗体融合蛋白质

目的建立高效亲和色谱检测抗体融合蛋白质的方法,用于抗体及抗体融合蛋白质生产的过程控制。方法正压匀浆法装填rProtein A Sepharose,用不同pH值缓冲液分步洗脱。结果在25~1 000μg/mL浓度范围内,重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(TNFR-Fc)浓度和峰面积显著相关,r=0.999 6;回收率范围为91%~99%,对表达TNFR-Fc的CHO工程细胞的不同培养阶段的3份上清分别进行3次重复测定,RSD在2%以内。结论该方法适用于抗体及抗体融合蛋白质生产的过程控制。     

重组人凝血因子Ⅷ结构改造的研究进展

血源凝血因子Ⅷ是血液凝固过程中关键因子,为治疗甲型血友病的特效药,但存在价格昂贵、给药频率高和潜在的病毒污染风险等缺点;且由于血液制品来源有限,凝血因子Ⅷ类药物在国内供不应求。随着基因工程技术的发展,药用重组人凝血因子Ⅷ得以实现,在此基础上大量针对重组人凝血因子Ⅷ的结构改造研究不断涌现,部分产品已投放市场。文章主要对哺乳动物细胞表达的各类改构重组人凝血因子Ⅷ的原理和研究进展进行综述。由于存在提高蛋白质稳定性及延长药物半衰期等优势,结构改造将是重组人凝血因子Ⅷ类药物未来的技术发展方向。     

金黄色葡萄球菌肠毒素C2中缺口的形成及影响因素的研究

目的:探索影响金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)断裂的因素.方法:将纯化的肠毒素在不同条件下处理,观察环境因素对其断裂程度的影响.结果:重组SEC2断裂的位置可能位于其分子93位半胱氨酸与110位半胱氨酸之间.重组SEC2在37℃下、24 h内会完全产生断裂,在碱性条件下则加速其断裂的形成;H2O2会导致重组SEC2产生非特异性降解.当溶液中有β-巯基乙醇(2%)、苯甲基磺酰胺(5～10 mmol/L)、咪唑(1 mol/L)或大肠杆菌粗提物时,重组SEC2的断裂可被有效抑制.结论:肠毒素C2容易在特定位点发生断裂,可能与蛋白质本身结构有关.