哺乳动物细胞西尼罗病毒样颗粒表达、纯化及其鉴定

目的利用哺乳动物细胞表达含有西尼罗病毒(WNV)prM和E蛋白,形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),为西尼罗病毒感染的免疫诊断试剂的研制奠定基础。方法筛选典型西尼罗病毒株,构建重组质粒,转染293T细胞,表达并纯化西尼罗病毒prM-E蛋白,利用透射电镜、免疫印迹试验、间接免疫荧光实验(IFA)和酶链免疫吸附试验(ELISA)对表达产物进行鉴定。结果重组质粒转染细胞后产生病毒样颗粒(viruslike particles VLPs),转染细胞上清纯化物中透射电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的病毒样颗粒蛋白能够与抗西尼罗病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性;间接ELISA证实,重组蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在哺乳动物细胞中表达的西尼罗病毒样颗粒具有良好的抗原性,为西尼罗病毒感染快速特异诊断试剂研制奠定了基础。     

基于症候群监测初步建立我国口岸入境人员传染病 监测网络及其2009-2011年监测结果分析

目的 了解我国入境人群发热症候群和腹泻症候群的病原谱构成数据,促进我国入境传染病网络实验室监测网络技术平台建立和完善.方法通过口岸体温监测、医学巡查、主动申报、健康体检等手段,于2009年5月-2011年3月间,联合9个直属检验检疫局所属口岸建立监测哨点并对筛选出的入境发热及腹泻人员进行样本采集、统一病原谱检测及数据分...     

应用DPO引物技术同时检测5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法

目的应用双启动寡核苷酸引物(Dual Priming Oligonucleotide,DPO)技术建立同时检测日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黄热病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus,SLEV)和登革病毒(Dengue virus,DV)5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法。方法利用Primer Premier5.0软件设计5种病毒的特异性DPO引物,对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化,测定多重RT-PCR反应的特异性和敏感性。结果应用DPO引物技术建立的多重RT-PCR方法可特异性扩增JEV、YFV、WNV、SLEV和DV的142 bp、293 bp、377 bp、630 bp和521 bp基因片段,灵敏度分别为5 000 PFU/ml、4 500 PFU/ml、2.3×105copies/μl、2.6×104copies/μl和1.37×104copies/μl,蚊虫模拟添加实验未发生非特异反应。结论应用DPO引物技术建立的针对5种蚊媒病毒的多重RT-PCR检测方法有良好的敏感性和特异性,可以同时对JEV、YFV、WNV、SLEV和DV进行检测。     

Nonidet P-40裂解流感病毒及其对抗体结合影响的透射电镜观察

目的 利用TEM观察经Nonidet P-40处理的A型流感病毒表面形态变化,研究不同表面活性剂-病毒表面相互作用情况,以提供一种较为温和的病毒表面裂解条件,并考察表面活性剂存在条件下对病毒表面抗体结合作用的影响,为利用病毒内部抗体结合病毒下层结构提供免疫诊断学理论基础.方法 通过用不同浓度的非离子型表面活性剂NP-40对完整的A型流感病毒进行处理,经透射电子显微镜成像,观察两种试剂对病毒表面形态的破坏程度,并考察病毒抗体结合情况.结果 NP-40各浓度对病毒表面破坏程度不一,病毒随浓度增高降解程度增大,但在0.1%NP-40及以下浓度上对抗体结合作用影响不大.结论 通过表面活性剂优化处理病毒颗粒,对抗体的结合会产生影响,本研究为利用流感病毒内层抗体结合包膜病毒奠定了样本处理的理论基础.     

液相中炭疽杆菌形貌的原子力显微镜观测

目的利用原子力显微镜液相模式观测炭疽杆菌形态,获得液相中炭疽杆菌芽胞和繁殖体对于溶菌酶的形态学抗性变化数据。方法应用原子力显微镜液相模式观察炭疽杆菌繁殖体及芽胞的超微结构,并对其主要指标进行测量比较。结果1×PBS溶液中的炭疽杆菌繁殖体,菌体杆状,竹节样排列,菌体间连接致密,长度为2,757.30±1227.086nm,宽度为1,710.90±226.10nm,Rq为15.447±3.418nm,Ra为13.239±2.733nm;炭疽杆菌芽胞椭圆形,多散在分布,表面平滑,长度为2,014.00±227.155nm,宽度为1,264.10±132.180nm,Rq为22.803±5.660nm,Ra为18.010±4.568nm。0.01 mg/mL溶菌酶溶液中的炭疽杆菌繁殖体形态不规则,表面凹凸起伏,边缘粗糙,有囊状突起,长度为2,836.00±1025.137nm,宽度为2,449.00±212.78nm,Rq为17.068±4.427nm,Ra为14.776±3.746nm;0.01 mg/mL溶菌酶溶液中的炭疽杆菌芽胞,形态规则,边缘平滑,未见凹凸起伏和囊状突起,而1 mg/mL溶菌酶溶液环境中的炭疽杆菌芽胞形态不规则,表面起伏,变化较大,其长度为2,155.00±202.663nm,宽度为1,344.00±162.631nm,Rq为24.849±3.427nm,Ra为20.869±2.550nm。结论通过原子力显微镜液相模式下的观察和测量,清楚地显示了溶液中炭疽杆菌的微观形貌及其变化,0.01 mg/mL的溶菌酶就能使炭疽杆菌繁殖体发生形态学变化,而炭疽杆菌芽胞形貌发生变化则需要1 mg/mL的高浓度溶菌酶的作用。     

甲型流感病毒亚型抗原肽合成及其免疫反应性比较鉴定

〔目的〕针对甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白同一区段不同亚型的合成肽,比较分析其免疫反应性和交叉反应性,获取具有免疫诊断学意义的抗原肽。〔方法〕通过生物信息学分析,针对新甲型H1N1、季节性H1N1、H2N2、H3N2和H5N1共5种亚型甲型流感病毒,选择2个HA肽段区位设计2组抗原肽段(19肽和23肽)合成,每组5条共10条,并分别与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)载体偶联形成全抗原后,免疫家兔制备兔源抗体,建立免疫反应性筛选的酶联免疫吸附法(ELISA),比较合成肽的免疫反应性。〔结果〕以阳性血清平均OD490nm/阴性血清平均OD490nm(P/N)值为判断标准,筛选出具有免疫反应性的2条特异性抗原肽(KYVKSTKLRLAT-GLRNVPS,VKNGTYDYPQYSEEARLNREEIS),前者具有亚型特异反应性,后者则具有一定的亚型通用免疫反应性。〔结论〕筛选出具有免疫反应性合成肽抗原,为进一步建立流感病毒亚型的快速鉴定诊断方法奠定了基础。     

快速检测日本脑炎病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立

[目的]建立一种能快速区分、简便诊断日本脑炎病毒的胶体金标记免疫层析试纸条方法,并对其进行评价。[方法]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并标记日本脑炎病毒的NS1的抗体,制成免疫层析检测试纸条。对试纸条进行特异性和敏感性评价,并对三带喙库蚊进行模拟添加日本脑炎病毒检测。[结果]用三带喙库蚊研磨悬液上清、正常的昆虫细胞液进行测试,呈阴性反应;检测日本脑炎病毒的灵敏度均为1×10^5pfu／ml,对三带喙库蚊添加日本脑炎病毒进行检测也取得同样结果,并在10～15min即可得到结果。[结论]初步建立了一种可以用于现场快速检测日本脑炎病毒的胶体金免疫层析方法,为进一步大规模应用奠定了基础。