人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

大黄素甲醚对大鼠急性肝损伤的保护作用

目的 探讨大黄有效成分大黄素甲醚对急性肝损伤的保护作用.方法 以2 ml/kg体质量四氯化碳(CCl4)灌服雄性Wistar大鼠3 d诱导急性肝损伤动物模型,观察大黄素甲醚对实验性肝损伤大鼠血清酶含量、血清肿瘤坏死因子(TNF)水平及肝组织病理学改变的影响.结果 大黄素甲醚组与模型组相比,血清酶学指标[ALT(U/L):(670.3±42.0)vs(917.1±78.0),AST(U/L):(1 157.2±86.2)vs(2 701.4±108.4)]及TNF水平明显降低[(1.6±0.3)μg/L vs(2.1±0.4)μg/L](均P＜0.05).大黄素甲醚组肝组织病理改变较模型组明显减轻.结论 大黄素甲醚对大鼠急性肝损伤具有保护作用.     

重组人睾丸精子结合蛋白对人精子获能及膜功能的影响

目的:探讨重组人睾丸精子结合蛋白(testis sperm binding protein,TSBP)对人精子获能及膜功能的影响。方法:采集22例健康生育男性新鲜精液样本,精子经Percoll密度梯度离心法优化处理后与不同浓度的重组人睾丸精子结合蛋白分别孵育培养1h或3h,取培养后精子进行孕酮诱导顶体反应与精子膜低渗肿胀功能检测。结果:0.1mg/mlTSBP处理组孕酮诱导精子顶体反应率及精子膜尾部低渗肿胀率均明显高于对照组(P<0.05);0.01mg/mlTSBP处理组各指标与对照组无显著差异。结论:重组人睾丸精子结合蛋白在体外可以促进人精子获能,对精子的膜功能具有保护作用。     

二氢青蒿素对结肠癌细胞HCT116凋亡基因表达图谱的影响

 摘要: 目的 探讨二氢青蒿素（DHA）诱导的结肠癌细胞HCT116凋亡基因差异表达。方法 利用基因芯片RT ProfilerTM PCR Array Human Apoptosis 和实时定量PCR方法对DHA组和对照组HCT116细胞的84种凋亡基因表达进行mRNA水平的检测。结果 DHA组细胞中,35种凋亡基因表达水平显著改变,TNFα、TRAILR、CASP、GADD45等促凋亡基因的表达显著上调;BCL2、AKT、BAD等抗凋亡基因表达显著下调。结论 DHA通过复杂的分子机制诱导HCT116细胞凋亡。     

重组人睾丸精子结合蛋白对蛋白激酶A活性的影响

为探讨人睾丸精子结合蛋白(TSBP)在精子获能及顶体反应中可能发挥的作用,检测了TSBP重组蛋白在体外转染细胞系中对蛋白激酶A活性的影响。构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)B/tsbp,稳定转染HEK293细胞后,蛋白免疫印迹检测到培养细胞中融合蛋白的表达。选择表达量高的细胞克隆,扩增并用金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6-TSBP。用放射自显影法检测HEK293细胞中蛋白激酶A(PKA)活性,发现重组质粒转染组PKA活性高于对照组,确定了TSBP对PKA活性的促进作用。     

PI3K催化亚基p110α小干扰RNA对小鼠受精卵发育的影响

目的:利用特异性小发夹RNA(shRNA)表达质粒,研究IA型磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)催化亚基p110α对小鼠受精卵发育的影响。方法:把p110αshRNA表达质粒显微注射到受精卵中。确定能干扰p110α表达的shRNA的最适浓度。通过检测RNA干扰后的p110αmRNA水平和蛋白表达情况,证明干扰是否成功。在确定成功干扰p110α后,观察受精卵的形态变化、分裂率以及对MPF活性的影响。结果:p110α表达受到干扰后,MPF的活性明显降低,受精卵第一次有丝分裂受到干扰,卵裂率明显降低。结论:p110α可能通过影响MPF的活性,调控小鼠受精卵的早期发育,为进一步探讨PI3K信号转导通路在小鼠胚胎中的作用奠定了基础。     

Rab13 GTPase在大鼠睾丸中的表达及其与生精上皮周期的关系

目的 初步明确 Rab13 GTPase在大鼠精子发生及成熟过程中的表达情况和可能发挥的作用.方法 首先通过RT-PCR技术检测了Rab13 GTPase在不同日龄大鼠睾丸组织中的表达,又利用RT-PCR和Western-blot 检测了Rab13在大鼠不同组织中的表达情况,最后采用免疫组化技术检测Rab13 GTPase在大鼠不同期别生精上皮中的分布.结果 RT-PCR显示Rab13 GTPase mRNA水平在40日龄大鼠睾丸组织中表达达到最高峰;在40日龄大鼠,Rab13 GTPase在心、脑、肺、脾、睾丸等5种组织中均有表达,在肺组织中表达量最多;在精子细胞成熟过程中,Rab13在生精上皮基底部及生精细胞周围都有分布,在精子释放前则主要集中分布于生精上皮基底部.结论 Rab13 GTPase的分布,可能随生精上皮周期的变化而对精子发生过程具有一定的调节作用.     

S100钙结合蛋白A4在胃癌组织中的表达及意义

背景与目的：本研究探讨S100钙结合蛋白A4(S100 calcium-binding protein A4,S100A4)在胃癌旁正常组织、慢性胃炎、肠上皮化生、腺瘤样异型增生和胃癌的组织标本中的表达及与胃癌临床病理特征及预后的关系。方法：利用HE染色对所取胃组织标本进行病理组织学诊断;采用免疫组织化学方法检测标本S100A4蛋白的表达;实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time pdymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测S100A4 mRNA表达;蛋白[质]印迹法(Western blot)检测S100A4蛋白的表达;采用Kaplan-Meier分析累积生存率。结果：S100A4蛋白和mRNA的表达按以下顺序逐渐增加：胃癌旁正常组织<慢性胃炎<肠上皮化生<腺瘤样异型增生<胃癌。S100A4表达水平与肿瘤大小、浸润深度、淋巴管浸润、淋巴结转移和肿瘤TNM分期有关,但与患者的年龄和性别无关。在较大直径、较深浸润、淋巴结转移的胃癌和肠型癌中可发现S100A4基因的过表达。采用Kaplan-Meier单因素分析显示,弱或中度S100A4基因表达的患者与不表达的患者相比有较低的累积生存率。结论：在胃癌旁正常组织-慢性胃炎-肠上皮化生-腺瘤样异型增生-胃癌过程中,S100A4 mRNA和蛋白表达逐渐增高;S100A4表达与胃癌肿瘤大小、侵袭深度、淋巴结转移和不良预后呈正相关;S100A4过表达参与胃癌发生和演进过程,可以作为反映胃癌恶性程度的生物学指标。     

膳食诱导肥胖小鼠生殖功能变化的试验研究

[目的]探讨肥胖倾向(DIO)、抵抗和对照小鼠高脂饮食后性腺,睾丸精子数量、活动度的变化情况。[方法]小鼠高脂膳食19周,分离睾丸、附睾和精囊腺,并称重,检测精子活动度和精子数量。[结果]实验19周末,DIO组小鼠睾丸和附睾系数显著低于对照组小鼠;DIO小鼠的精子活动度显著低于对照组小鼠。[结论]长期肥胖可能影响小鼠生殖器官的发育,影响小鼠精液品质。